In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's
Summary
Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo’s. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo’s te bestuderen.
Abstract
Als een klassiek modelsysteem van embryobiologie is het kippenembryo gebruikt om embryonale ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken. Het afleveren van exogene materialen in kippenembryo’s heeft een groot voordeel voor het bestuderen van genfunctie, transgene fokkerij en chimaerapreparatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Hier tonen we de methode van in ovo intravasculaire injectie waarbij exogene materialen zoals plasmidevectoren of gemodificeerde primordiale geslachtscellen (PPC’s) in vroege ontwikkelingsstadia kunnen worden overgebracht naar donorkippyo’s. De resultaten tonen aan dat de intravasculaire injectie via de dorsale aorta en het hoofd het geïnjecteerde materiaal via de bloedsomloop in het hele embryo laat diffunderen. In het gepresenteerde protocol werden de werkzaamheid van exogene plasmide en lentivirale vectorintroductie en de kolonisatie van geïnjecteerde exogene PGB’s in de ontvangende gonade bepaald door fluorescentie in de embryo’s te observeren. Dit artikel beschrijft gedetailleerde procedures van deze methode, waardoor een uitstekende benadering wordt geboden voor het bestuderen van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en gonade-chimere kippenproductie. Kortom, dit artikel zal onderzoekers in staat stellen om in ovo intravasculaire injectie van exogene materialen in kippenembryo’s met groot succes en reproduceerbaarheid uit te voeren.
Introduction
Kippenembryo’s worden al eeuwenlang op grote schaal gebruikt in ontwikkelings-, immunologische, pathologische en andere biologische toepassingen 1,2,3. Ze hebben veel inherente voordelen ten opzichte van andere diermodellen in de studie van toxicologie en celbiologie4. Kippenembryo’s zijn gemakkelijk toegankelijk en kunnen in vitro worden gemanipuleerd en direct worden geobserveerd in elk ontwikkelingsstadium, wat een handig embryo-onderzoeksmodelsysteem biedt.
Over het algemeen hebben de huidige methoden voor het afleveren van kippenembryo’s zoals elektrotransfectie en subgerminale holte-injectie beperkingen zoals de vereiste van gespecialiseerde apparatuur en een ontworpen programma, en inefficiëntie als gevolg van de aanwezigheid van dooier en albumine 5,6,7. Hier tonen we een eenvoudige en efficiënte behandelingsmethode voor het afleveren van exogene materialen in kippenembryo’s. Dit kan een krachtig hulpmiddel zijn dat wordt gebruikt bij de studie van ontwikkelingsbiologie. De geïnjecteerde materialen verspreiden zich via de bloedcirculatie naar het hele embryo. Tijdens de vroege ontwikkeling van kippenembryo’s konden de PPC’s door bloed migreren, de genitale richel koloniseren en zich vervolgens ontwikkelen tot gameten, die een waardevol mogelijk pad bieden om exogene materialen af te leveren8. Nu is deze methode op grote schaal gebruikt in de studie van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en chimere en transgene kippenproductie 9,10,11.
In ovo is intravasculaire injectie in kippenembryo’s een gevestigde en veelgebruikte methode 12,13,14. In dit artikel tonen we een uitgebreide beschrijving van dit protocol, inclusief injectiematerialen, plaatsen, dosering en representatieve resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode van in ovo intravasculaire injectie van kippenembryo’s is geoptimaliseerd voor exogene materialen (vector, virale of PPC’s) die in het embryo moeten worden overgebracht. Op basis van deze methode construeerden we kippenembryomodellen met stabiele genoverexpressie of interferentie (SpinZ, JUN, UBE2I, enz.) 17,18,19. Deze gevestigde modellen bewijzen de haalbaarheid van deze aanpak. Bovendien hebben we niet al…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31972547). We waarderen de copyediting door Jing Wang en de voice-over door Malik Donlic aan de Washington State University, USA.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
Referencias
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
