カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法
Summary
薬剤耐性カン ジダ・アルビカンス の発生率の増加は、世界中で深刻な健康問題です。抗菌光線力学療法(aPDT)は、薬剤耐性真菌感染症と戦うための戦略を提供するかもしれない。本プロトコールは、多剤耐性 C.アルビカン ス株に対するローズベンガル媒介性aPDT有効性を インビトロで記載する。
Abstract
侵襲性 カンジダ・アルビカンス 感染症は、腸、口、膣、および皮膚の最も一般的な植民者の1つであるため、ヒトにおける重要な日和見真菌感染症である。抗真菌薬が利用可能であるにもかかわらず、侵襲性カンジダ症の死亡率は〜50%のままである。残念なことに、薬剤耐性の C.アルビカンの発生 率は世界的に増加しています。抗菌光線力学療法(aPDT)は、 C.アルビカンス バイオフィルム形成を阻害し、薬物耐性を克服するための代替またはアジュバント治療を提供し得る。ローズベンガル(RB)媒介性aPDTは、細菌および C.アルビカンスの効果的な細胞死滅を示している。この研究では、多剤耐性 C.アルビカンス に対するRB−aPDTの有効性が記載されている。自家製の緑色発光ダイオード(LED)光源は、96ウェルプレートのウェルの中心に合わせるように設計されています。酵母を異なる濃度のRBを有するウェルでインキュベートし、様々な緑色の光のフルエンスで照らした。殺傷効果をプレート希釈法により分析した。光とRBの最適な組み合わせにより、3対数の成長阻害が達成された。RB-aPDTは薬剤耐性 のC.アルビカンスを潜在的に阻害する可能性があると結論付けられた。
Introduction
C.アルビカンスは 、健常人の胃腸管および尿生殖路に定着し、個体の約50%において正常な微生物叢として検出され得る1。宿主と病原体との間に不均衡が生じると、 C. albicans は侵入して病気を引き起こす可能性があります。感染は、局所粘膜感染から多臓器不全2までの範囲であり得る。米国の多施設サーベイランス研究では、2009年から2017年の間に侵襲性カンジダ症患者からの分離株の約半分が C. albicans3である。カンジデミアは、高い罹患率、死亡率、長期入院4と関連している可能性がある。米国疾病管理予防センターは、試験されたすべてのカンジダ血液サンプルの約7%が抗真菌薬フルコナゾールに耐性があると報告しました5。薬剤耐性 カンジダ 種の出現は、抗真菌剤に代わるものまたはアジュバント療法を開発する懸念を提起する。
抗菌光線力学療法(aPDT)は、PS6のピーク吸収波長の光で特定の光増感剤(PS)を活性化することを含む。励起後、励起されたPSは、そのエネルギーまたは電子を近くの酸素分子に伝達し、基底状態に戻る。このプロセスの間に、活性酸素種および一重項酸素が形成され、細胞損傷を引き起こす。aPDTは1990年代から微生物を殺すために広く使用されてきた7。aPDTの利点の1つは、照射中に複数の細胞小器官が一重項酸素および/または活性酸素種(ROS)によって細胞内で損傷を受けることである。したがって、aPDTに対する耐性は今日まで見出されていない。さらに、最近の研究では、aPDT後に生き残った細菌が抗生物質に対してより敏感になったことが報告されています8。
aPDTで使用される光源には、レーザー、フィルター付き金属ハロゲンランプ、近赤外光、発光ダイオード(LED)9、10、11、12などがあります。レーザーは、通常0.5 W/cm2より大きい高い光パワーを提供し、非常に短時間で高い光線量を送達することを可能にする。口腔感染症に対するaPDTのように、治療時間が長くなると不便な場合に広く用いられている。レーザーの欠点は、照明のスポットサイズが小さく、ディフューザーで数百マイクロメートルから10mmの範囲であることです。さらに、レーザー装置は高価であり、操作するには特定のトレーニングが必要です。一方、フィルター付き金属ハロゲンランプの照射面積は比較的大きい13。しかし、ランプはあまりにも重くて高価です。LED光源は小型で安価であるため皮膚科学分野でaPDTの主流となっている。照射面積は、LED電球のアレイ配置で比較的大きくすることができる。顔全体を同時に照らすことができる9.それにもかかわらず、すべてではないにしても、今日利用可能なLED光源のほとんどは、臨床使用のために設計されています。スペースを占有し、高価であるため、ラボでの実験には適していない可能性があります。私たちは、非常に小さく、LEDストリップから切断して組み立てることができる安価なLEDアレイを開発しました。LEDは、異なる実験計画のために異なる配置に適合させることができる。aPDTの異なる条件は、1回の実験で96ウェルプレートまたは384ウェルプレートで完了することができる。
ローズベンガル(RB)は、ヒトの目14における角膜損傷の可視化を強化するために広く使用されている着色染料である。RB媒介性aPDTは、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびC.アルビカンスに対して、トルイジンブルーO15のそれとほぼ同等の効率で殺傷効果を示した。この研究は、多剤耐性C.アルビカンスに対するRB-aPDTの効果を検証する方法を実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
真菌性角膜炎に対するRB−PDTの臨床応用の有望な結果が最近報告されている19。RBの吸収ピークは450〜650nmにある。aPDTを成功させるためには、光源のフルエンス率を決定することが不可欠です。がん細胞の治療には高いフルエンス(通常>100J/cm2)が必要であり、感染病変の治療には低いフルエンスが必要であると予想される6。高いフルエンスは、臨床?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、文部(MOE)による高等教育スプラウトプロジェクトの枠組みの中で、国立成昆大学応用ナノ医学センター、国立成昆大学から資金提供を受けており、台湾科学技術部[MOST 109-2327-B-006-005]からTW Wongに資金提供を受けています。J.H. Hungは、台湾の国立成昆大学病院[NCKUH-11006018]および[MOST 110-2314-B-006-086-MY3]からの資金提供を認めています。
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
Referencias
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