Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.
Como la superficie transparente del ojo, la córnea es fundamental para una visión clara. Debido a su ubicación, este tejido es propenso a los insultos ambientales. De hecho, las lesiones oculares que se encuentran clínicamente con mayor frecuencia son las de la córnea. Si bien la cicatrización de heridas corneales se ha estudiado ampliamente en pequeños mamíferos (es decir, ratones, ratas y conejos), los estudios de fisiología corneal han descuidado otras especies, incluido el pez cebra, a pesar de que el pez cebra es un modelo de investigación clásico.
Este informe describe un método para realizar una abrasión corneal en el pez cebra. La herida se realiza in vivo en peces anestesiados utilizando una rebaba ocular. Este método permite una herida epitelial reproducible, dejando el resto del ojo intacto. Después de la abrasión, el cierre de la herida se controla en el transcurso de 3 h, después de lo cual la herida se reepiteliza. Mediante el uso de microscopía electrónica de barrido, seguida de procesamiento de imágenes, se puede investigar la forma de la célula epitelial y las protuberancias apicales para estudiar los diversos pasos durante el cierre de la herida epitelial corneal.
Las características del modelo de pez cebra permiten estudiar la fisiología del tejido epitelial y el comportamiento colectivo de las células epiteliales cuando el tejido es desafiado. Además, el uso de un modelo privado de la influencia de la película lagrimal puede producir nuevas respuestas con respecto a la respuesta corneal al estrés. Finalmente, este modelo también permite la delineación de los eventos celulares y moleculares involucrados en cualquier tejido epitelial sometido a una herida física. Este método se puede aplicar a la evaluación de la eficacia del fármaco en las pruebas preclínicas.
Como la mayoría de los epitelios están en contacto con el entorno externo, son propensos a lesiones físicas, lo que los hace muy adecuados para el estudio de los procesos de curación de heridas. Entre los tejidos bien estudiados, la córnea es un modelo extremadamente útil en la investigación de los aspectos celulares y moleculares de la cicatrización de heridas. Como superficie externa transparente, proporciona protección física al ojo y es el primer elemento para enfocar la luz en la retina. Si bien la estructura y la composición celular de la retina difieren entre las especies1, estos elementos de la córnea son generalmente similares en todos los ojos de tipo cámara, independientemente de la especie.
La córnea se compone de tres capas principales2. La primera y más externa capa es el epitelio, que se renueva constantemente para garantizar su transparencia. La segunda capa es el estroma, que contiene células dispersas, llamadas queratocitos, dentro de una capa gruesa de fibras de colágeno estrictamente organizadas. La tercera capa más interna es el endotelio, que permite la difusión de nutrientes y líquidos desde la cámara anterior a las capas externas. Las células epiteliales y estromales interactúan a través de factores de crecimiento y citoquinas3. Esta interacción se pone de manifiesto por la rápida apoptosis y posterior proliferación de queratocitos tras lesión epitelial 4,5. En caso de una herida más profunda, como una punción, los queratocitos toman parte activa en el proceso de curación6.
Al estar en contacto con el entorno externo, las lesiones físicas corneales son comunes. Muchos de ellos son causados por pequeños objetos extraños7, como arena o polvo. El reflejo del frotamiento ocular puede dar lugar a abrasiones epiteliales extensas y remodelación corneal8. De acuerdo con el tamaño y la profundidad de la herida, estas lesiones físicas son dolorosas y tardan varios días en sanar9. Las características óptimas de cicatrización de heridas de un modelo facilitan la comprensión de los aspectos celulares y moleculares del cierre de heridas. Además, tales modelos también han demostrado ser útiles para probar nuevas moléculas con el potencial de acelerar la curación corneal, como se demostró previamente10,11.
El protocolo descrito aquí tiene como objetivo utilizar el pez cebra como un modelo relevante para estudiar la lesión física corneal. Este modelo es muy conveniente para los estudios de cribado farmacológico, ya que permite que las moléculas se agreguen directamente al agua del tanque y, por lo tanto, entren en contacto con una córnea curativa. Los detalles proporcionados aquí ayudarán a los científicos a realizar sus estudios sobre el modelo de pez cebra. La lesión in vivo se realiza con una rebaba ocular opaca. El impacto en las células epiteliales adyacentes o a distancia de él se puede analizar eliminando específicamente el epitelio corneal central. En los últimos años, numerosos informes se centraron en dicho método en la córnea de roedores 12,13,14,15,16,17; sin embargo, hasta la fecha, sólo un informe ha aplicado este método al pez cebra18.
Debido a su simplicidad, la herida física es útil para delinear el papel de las células epiteliales en el cierre de la herida. Otro modelo bien establecido de lesión corneal es la quemadura química, especialmente la quemadura alcalina 19,20,21. Sin embargo, tal enfoque daña indirectamente toda la superficie del ojo, incluida la córnea periférica y el estroma corneal19. De hecho, las quemaduras alcalinas potencialmente inducen úlceras corneales, perforaciones, opacificación epitelial y neovascularización rápida22, y el resultado incontrolable de las quemaduras alcalinas descalifica ese enfoque para los estudios generales de cicatrización de heridas. También se utilizan muchos otros métodos para investigar la cicatrización de heridas corneales de acuerdo con el enfoque particular del estudio en cuestión (por ejemplo, desbridamiento epitelial completo23, la combinación de lesiones químicas y mecánicas para heridas de espesor parcial24, ablación con láser excímero para heridas que se extienden hasta el estroma25). El uso de una rebaba ocular restringe el punto focal a la respuesta epitelial a la herida y proporciona una herida altamente reproducible.
Al igual que con cada método de infligir heridas, el uso de una rebaba ocular tiene ventajas y desventajas. La principal desventaja es que la respuesta es en su mayoría epitelial, no refleja perfectamente las abrasiones observadas en el entorno clínico. Sin embargo, este método tiene numerosas ventajas, incluida la facilidad con la que se puede configurar y realizar, su precisión, su reproducibilidad y el hecho de que no es invasivo, lo que lo convierte en un método bien tolerado por los animales.
Las lesiones físicas corneales son la causa más común de visitas de pacientes oftalmológicos al hospital. Por lo tanto, es importante establecer modelos relevantes para el estudio de diferentes aspectos de la fisiopatología corneal. Hasta ahora, el ratón es el modelo más utilizado para el estudio de la cicatrización de heridas corneales. Sin embargo, agregar gotas para los ojos en los ojos heridos murinos para validar el impacto de medicamentos específicos en la cicatrización de heridas corneales puede ser dif?…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Pertti Panula por el acceso a la unidad de pez cebra y a Henri Koivula por la orientación y ayuda con los experimentos del pez cebra. Esta investigación fue apoyada por la Academia de Finlandia, la Fundación Jane y Aatos Erkko, la Fundación Cultural Finlandesa y el Programa ATIP-Avenir. Las imágenes se realizaron en la unidad de Microscopía Electrónica y la Unidad de Microscopía de Luz, Instituto de Biotecnología, con el apoyo de HiLIFE y Biocenter Finland.
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
Dissecting plate | in-house | ||
Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
double-distilled water | in-house | ||
Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
mounts | Agar Scientific | G301P | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
Plastic spoons | any provider | ||
Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
Soft sponge | any provider | ||
Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
Stereomicroscope | Leica |