MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu
Summary
Mevcut protokol, mikroRNA’ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA’larla sonuçlanır.
Abstract
Keneler, çoklu patojenleri vektörleştirebilen önemli ektoparazitlerdir. Kenelerin tükürük bezleri beslenme için gereklidir, çünkü tükürükleri konakçı bağışıklık tepkilerini azaltabilen ve patojen iletimini artırabilen farmasötik özelliklere sahip birçok efektör içerir. Bu tür efektörlerin bir grubu mikroRNA’lardır (miRNA’lar). miRNA’lar, kene-konakçı arayüzünde ve kene organlarında konakçı gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan dizilerdir. Bu küçük RNA’lar, kene tükürüğünde, hücreler arası ve hücre içi iletişime hizmet eden hücre dışı veziküller (EV’ler) aracılığıyla taşınır. Kenelerin tükürüğünde miRNA’lar içeren veziküller tanımlanmıştır. Bununla birlikte, miRNA’ların kene tükürük vezikülleri ve bezlerindeki rolleri ve profilleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, kene tükürüğündeki veziküllerin ve miRNA’ların incelenmesi, kene tükürüğünü toplamak için sıkıcı prosedürler gerektirir. Bu protokol, miRNA’ları ex vivo organ kültürleri tarafından üretilen saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izole etmek için bir yöntem geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçlamaktadır. MiRNA’ları hücre dışı veziküllerden ve tükürük bezlerini kene tükürük bezlerinden çıkarmak için gereken materyaller ve metodoloji burada açıklanmıştır.
Introduction
Keneler, birçok patojeni vahşi yaşama, hayvancılığa, insanlara ve evcil hayvanlarına vektör eden ektoparazitlerdir 1,2. Kene besleme, saklanmaya zarar vererek, şiddetli anemi nedeniyle kilo ve süt üretimini azaltarak ve potansiyel olarak ölümcül hastalığa neden olan patojenlerin bulaşmasına neden olarak önemli ekonomik kayıplara neden olur 1,3,4,5. Kene popülasyonlarını yönetmek için mevcut kontrol uygulamaları, akarisitlerin kullanımına odaklanmıştır. Bununla birlikte, hayvancılıkta parazitleştiren kenelerde akarisit direncinin sürekli ortaya çıkması5,6, kene ısırığı insidansının artması 7 ve yerleşim bölgelerinde patojen bulaşması8,9, benzersiz kene kontrol alternatiflerine ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur.
Kene tükürük bezleri, bir kenenin biyolojik başarısını sağlayan temel organlardır. Çeşitli fizyolojik fonksiyonlara sahip farklı acinus tipleri (I, II, III ve IV) tarafından oluşturulurlar. Tükürük bezleri, tükürüksalgısı 2,10 yoluyla su fazlalığını ve demir içeriğini konakçıya geri döndürerek hem kapalı hem de konakçı üzerinde ozmoregülasyondan sorumludur. Tip I acini ayrıca higroskopik tükürük10,11 salgılanmasıyla atmosferden su alımında da rol oynar. Çimento ve sistatinler gibi tükürük efektör proteinleri, tip II ve III acini10,12’de salgı hücreleri içinde üretilir. Tip I acini kene beslenmesini etkilemez, bu da kan unu alımının bu acini tip13,14’te morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri tetiklemediğini gösterir. Öte yandan, Acini tip II ve III beslenme sırasında aktive edilir ve bağlanma öncesi çok az aktivite gösterir. Bu nedenle, tip II acini içindeki salgı hücrelerinin genişlemesini ve biyoaktif bileşiklerin üretimini tetiklemek için besleme gereklidir. Tip III acini, salgı granülleri12 içindeki sekresyon nedeniyle beslenme sırasında küçültülür.
Tükürük bezleri ayrıca kene ve bulaşma yolunda patojen enfeksiyonun yeridir. Beslenme sırasında, keneler kan unu10,15,16’nın başarılı bir şekilde tamamlanması için gerekli olan farmasötik etkileri olan birkaç bileşik salgılarlar. Bu bileşikler anti-enflamatuar, immünsüpresif ve vazodilatatör özelliklere sahiptir10,15,17. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kene tükürük bezlerinden türetilen hücre dışı veziküllerin (EV’ler) bu bileşiklerin birkaçını barındırdığını ve anti-enflamatuar ve immüno-modülatör etkileri indüklediğini göstermiştir18,19,20. “Hücre dışı veziküller”, boyutlarına ve biyogenezlerine göre eksozomlar ve mikro-parçacıklar olarak sınıflandırılan vezikülleri tanımlamak için kullanılan bir şemsiye terimdir. Genel olarak, EV’ler,21 boyutunda ~ 40 nm-1 μm olan çift katmanlı membranlara sahip lipit blebleridir; Genel olarak, eksozomlar 40-150 nm boyutundayken, mikro-parçacıklar 21,22,23 boyutunda 150 nm-1 μm arasındadır. Bununla birlikte, boyut EV’lerin biyogenez yolu22’nin göstergesi değildir.
Eksozomların biyogenezi, plazma zarının sıralı invaginasyonu ile başlar. Bu invaginasyon, multiveziküler cisimlerin oluşumuna yol açar ve son olarak ESCRT komplekslerinin veya sfingomiyelinazların (sMases) etkisiyle veziküler membranın deformasyonuna neden olur24,25. Eksozomlar, hücresel homeostazı korumak için lizozomlar içinde lizozomlar içinde lize edilebilir veya alıcı hücrelere hücresel bileşenler vermek için veziküler füzyon yoluyla plazma zarına çıkabilir21,24. Öte yandan, mikro-parçacıklar, plazma zarındaki lipitlerin konformasyonunu değiştiren flopassların ve flipassların etkisiyle oluşur26. EV’ler hücreden hücreye iletişim için gereklidir ve lipitler, proteinler, nükleik asitler ve mikroRNA’lar (miRNA’lar) gibi hücre içi kargolar için bir taşıma sistemi görevi görür21,27,28. Taşındıktan sonra, bu veziküller yüklerini alıcı hücrelerin sitoplazmasına teslim eder ve alıcı hücrede fenotipik değişiklikler üretir22,29. Kene beslenmesinde hücre dışı veziküllerin önemi ve konakçı immün ve yara iyileşmesi yanıtlarının manipülasyonu18,20 nedeniyle, hücre dışı veziküller içindeki kargo, kene önleyici terapötiklerin gelişimi için potansiyel hedefler ve kene beslenmesini bozmak için benzersiz bir mekanizma sunmaktadır. Bu, kene tükürük bezleri içindeki miRNA’ları ve tükürük bezi kaynaklı hücre dışı vezikülleri içerir.
miRNA’lar, mRNA dizilerini30,31 post-transkripsiyonel olarak düzenleyebilen, bozabilen veya susturabilen ~ 18-22 nükleotid (nt) uzunluğunda kısa kodlamayan dizilerdir. Transkripsiyon sırasında, pri-miRNA’lar Dicer (RNA polimeraz III) tarafından ayrılarak ayırt edici bir saç tokası benzeri yapı oluşturur ve bir pre-miRNA haline gelir. Pre-miRNA, olgun bir miRNA dubleks oluşturmak için Drosha (RNA polimeraz III) tarafından bir kez daha kesilir. Olgun dizi, mRNA dizisini tamamlayan RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) entegre olur ve translasyon baskısına veya mRNA bozulmasına neden olur 28,30,32. Konakçı beslenmesi sırasında, kene tükürüğü içindeki miRNA’lar, bağışıklık tepkilerini baskılamak ve patojen iletimini arttırmak için konakçı gen ekspresyonunu modüle edebilir 33,34,35,36,37. EV’ler ve miRNA’lar üzerinde kapsamlı çalışmalar olmasına rağmen, kene-konakçı arayüzünde beslenme sırasındaki rolleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yüksek kaliteli miRNA’ların izolasyonu ve saflaştırılmasıyla kolayca sonuçlanabilecek protokollerin optimize edilmesi, bu konulardaki bilgimizi ilerletmek için çok önemlidir.
EV’leri izole etmek için ultrasantrifüjleme, eksozom çökeltme, polimer çökeltme, immünoaffinite kromatografisi ve boyut tabanlı dışlama teknikleri gibi çoklu seçenekler kullanılabilir38. Bununla birlikte, bu teknikler eksozomlar veya mikro-parçacıklar arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, daha önce de belirtildiği gibi, EV, EV’leri farklı örneklerden izole ederken şemsiye bir terim olarak kullanılır. Burada açıklanan deneylerde izole edilen veziküller, farklı biyogenez yollarından türetilen veziküllerin bir karışımını temsil eder. Belirli bir hücre dışı vezikül popülasyonunun daha fazla saflaştırılması, ilgilenilen vezikül popülasyonuna özgü belirteçlere (yani, ekzozomal belirteçler, tümör belirteçleri) karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak immünopresipitasyon ile sağlanabilir39,40. miRNA’lar ayrıca ticari olarak temin edilebilen farklı izolasyon kitleri 7,41,42 aracılığıyla da ekstrakte edilebilir.
Bu projenin amacı, EV’leri izole etmek ve miRNA’yı hem EV’lerden hem de beslenen kene tükürük bezlerinden çıkarmak için yaygın olarak uygulanan yöntemleri birleştiren bir protokol geliştirmekti. Biyoaktif bileşiklerin salgılanması12 besleme ile aktive edildiğinden, konakçı immün ve yara iyileşme yanıtlarını manipüle etmek için önemli olabilecek miRNA’ları tanımlamak için kenelerin beslenmesine izin verilmelidir. Mevcut protokol, EV’leri ve ilgili miRNA’larını izole etmek için az sayıda kene (20 kene) gerektirir, 2000 kene gerektiren daha önce tanımlanmış diğer çalışmalara kıyasla43. Ayrıca, tükürük sekresyonlarının pilokarpin44 ile kirlenmesini önler, bu da EV’lerin ve miRNA’larının konakçı hücreler üzerindeki etkisini inceleyen deneyleri etkileyebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, tükürük bezlerinden ve EV’lerden miRNA’nın çıkarılması için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Bununla birlikte, hepsi bu protokolün her bölümünün notlarında ayrıntılı olarak açıklanan önemli hususlar vardır. Kenelerin kaçmasını önlemek için kene besleme sırasında kapsül ve ağ ağı sabitlenmelidir. Kapsül hazırlama ve yerleştirme Koga ve ark.40’ta açıklanmıştır. Uygun olmayan bir numune atılırsa, kene diseksiyonlarının birkaç kop…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Edinburg, Teksas’taki Sığır Ateşi Kene Laboratuvarı’nın yardımı için çok minnettarız. Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado ve Homer Vasquez’e teşekkür ederiz. Proje boyunca Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario ve Stephanie Guzman Valencia’nın yardımlarına da teşekkür ederiz. Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group’a bu makalenin yazılması sırasındaki yardım ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Aşağıdaki reaktifler BEI Resources, NIAID, NIH tarafından dağıtılmak üzere Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sağlanmıştır: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Dişi I. scapularis keneleri de Oklahoma Eyalet Üniversitesi’ndeki Kene Yetiştirme Tesisi’nden alındı. Bu proje Texas A & M Üniversitesi T3 tarafından finanse edildi: dönüşüm hibesi için üçlü ve USDA-ARS tarafından AOC’ye yapılan işbirliği anlaşması #58-3094-1-003.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
Referencias
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
- de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
- Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , 603-672 (2019).
- Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
- Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
- Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
- Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
- Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
- Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
- Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
- Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
- Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
- Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
- Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
- Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
- Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
- Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
- Chávez, A. S. O., O’Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
- Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
- Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
- Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
- Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
- Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
- Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. . Proteomic Profiling. , 179-209 (2015).
- Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
- Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
- Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
- Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
- Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
- Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
- Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2011).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
- Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
- Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
- Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
- Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
- Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).
