Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios
Summary
La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.
Abstract
La inmunidad hereditaria describe cómo algunos animales pueden transmitir el “recuerdo” de una infección previa a su descendencia. Esto puede aumentar la resistencia de los patógenos en su progenie y promover la supervivencia. Si bien se ha reportado inmunidad hereditaria en muchos invertebrados, los mecanismos subyacentes a este fenómeno epigenético son en gran parte desconocidos. La infección de Caenorhabditis elegans por el patógeno microsporidio natural Nematocida parisii da como resultado que los gusanos produzcan descendencia que es robustamente resistente a los microsporidios. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad intergeneracional en el modelo de infección simple y genéticamente tratable de N. parisii –C. elegans . El artículo actual describe métodos para infectar a C. elegans y generar descendencia inmuno-preparada. También se proporcionan métodos para evaluar la resistencia a la infección por microsporidios mediante la tinción de microsporidios y la visualización de la infección por microscopía. En particular, la inmunidad hereditaria previene la invasión de células huésped por microsporidios, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se puede utilizar para cuantificar los eventos de invasión. La cantidad relativa de esporas de microsporidios producidas en la descendencia inmunoprimida se puede cuantificar tiñendo las esporas con un tinte de unión a la quitina. Hasta la fecha, estos métodos han arrojado luz sobre la cinética y la especificidad del patógeno de la inmunidad hereditaria, así como los mecanismos moleculares subyacentes a ella. Estas técnicas, junto con las amplias herramientas disponibles para la investigación de C. elegans, permitirán importantes descubrimientos en el campo de la inmunidad hereditaria.
Introduction
La inmunidad hereditaria es un fenómeno epigenético por el cual la exposición de los padres a patógenos puede permitir la producción de descendencia resistente a las infecciones. Este tipo de memoria inmune se ha demostrado en muchos invertebrados que carecen de sistemas inmunes adaptativos y pueden proteger contra enfermedades virales, bacterianas yfúngicas 1. Si bien la inmunidad hereditaria tiene implicaciones importantes para comprender tanto la salud como la evolución, los mecanismos moleculares subyacentes a esta protección son en gran parte desconocidos. Esto se debe en parte a que muchos de los animales en los que se ha descrito la inmunidad heredada no son organismos modelo establecidos para la investigación. Por el contrario, los estudios en el nematodo transparente Caenorhabditis elegans se benefician de un extenso conjunto de herramientas genéticas y bioquímicas 2,3, un genoma altamente anotado 4,5 y un corto tiempo de generación. De hecho, la investigación en C. elegans ha permitido avances fundamentales en los campos de la epigenética y la inmunidad innata 6,7, y ahora es un modelo establecido para estudiar la memoria inmune 8,9.
Los microsporidios son patógenos fúngicos que infectan a casi todos los animales y causan infecciones letales en humanos inmunocomprometidos10. La infección comienza cuando una espora de microsporidios inyecta o “dispara” su contenido celular (esporoplasma) en una célula huésped utilizando una estructura llamada tubo polar. La replicación intracelular del parásito da como resultado la formación de merontes, que finalmente se diferencian en esporas maduras que pueden salir de la célula11,12. Si bien estos parásitos son perjudiciales tanto para la salud humana como para la seguridad alimentaria, aún queda mucho por aprender sobre su biología de la infección12. Nematocida parisii es un parásito microsporidio natural que se replica exclusivamente en las células intestinales de los gusanos, lo que resulta en una fecundidad reducida y, en última instancia, la muerte. El modelo de infección por N. parisii –C. elegans se ha utilizado para mostrar: (1) el papel de la autofagia en la eliminación de patógenos13, (2) cómo los microsporidios pueden salir de las células infectadas de forma no lítica14, (3) cómo los patógenos pueden propagarse de célula a célula mediante la formación de sincitia15, (4) las proteínas que N. parisii utiliza para interactuar con su huésped16, y (5) la regulación de la respuesta intracelular transcripcional del patógeno (IPR)17, 18.
Los protocolos para la infección de C. elegans se describen en el trabajo actual y se pueden utilizar para revelar la biología única de los microsporidios y diseccionar la respuesta del huésped a la infección. La microscopía de gusanos fijos teñidos con el tinte de unión a quitina Direct Yellow 96 (DY96) muestra la propagación de la infección de esporas de microsporidios que contienen quitina por todo el intestino. La tinción DY96 también permite la visualización de embriones de gusanos que contienen quitina para la evaluación simultánea de la gravedad del gusano (capacidad de producir embriones) como una lectura de la aptitud del huésped.
Trabajos recientes han revelado que C. elegans infectados con N. parisii producen descendencia que es robustamente resistente a la misma infección19. Esta inmunidad hereditaria dura una sola generación y depende de la dosis, ya que los hijos de padres más infectados son más resistentes a los microsporidios. Curiosamente, las crías preparadas con N. parisii también son más resistentes al patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, aunque no están protegidas contra el patógeno natural Virus Orsay19. El presente trabajo también muestra que la descendencia inmunoprimida limita la invasión de células huésped por microsporidios. El método también describe la colección de descendientes inmuno-cebados y cómo FISH se puede utilizar para detectar el ARN de N. parisii en las células intestinales para evaluar la invasión de la célula huésped y la activación de esporas20.
Juntos, estos protocolos proporcionan una base sólida para estudiar los microsporidios y la inmunidad hereditaria en C. elegans. Se espera que el trabajo futuro en este sistema modelo permita descubrimientos importantes en el campo naciente de la inmunidad heredada. También es probable que estas técnicas sean puntos de partida para investigar la inmunidad hereditaria inducida por microsporidios en otros organismos huéspedes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe el estudio de los microsporidios y la inmunidad hereditaria en un modelo de infección por N. parisii –C. elegans simple y genéticamente tratable.
La preparación de esporas es un protocolo intensivo que generalmente produce suficientes esporas para 6 meses de experimentos, dependiendo de la productividad24. Es importante destacar que se debe determinar la infectividad para cada nuevo “lote” de esporas antes de usarlo pa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Winnie Zhao y Yin Chen Wan por proporcionar comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención # 522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Referencias
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