Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).
Abstract
Die Phosphorylierung ist eine notwendige posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert und die Ergebnisse der Zellsignalisierung steuert. Aktuelle Methoden zur Messung der Proteinphosphorylierung können die Heterogenität der Phosphorylierung über einzelne Proteine hinweg nicht erhalten. Der Einzelmolekül-Pulldown-Assay (SiMPull) wurde entwickelt, um die Zusammensetzung makromolekularer Komplexe durch Immunpräzipitation von Proteinen auf einem Glasdeckglas zu untersuchen, gefolgt von Einzelmolekül-Bildgebung. Die aktuelle Technik ist eine Adaption von SiMPull, die eine robuste Quantifizierung des Phosphorylierungszustands von Membranrezeptoren in voller Länge auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die Abbildung von Tausenden von einzelnen Rezeptoren auf diese Weise ermöglicht die Quantifizierung von Proteinphosphorylierungsmustern. Das vorliegende Protokoll beschreibt das optimierte SiMPull-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung. Die Optimierung von Glaspräparations- und Antikörperfixierungsprotokollen verbessert die Datenqualität weiter. Das aktuelle Protokoll liefert Code für die Einzelmolekül-Datenanalyse, die den Anteil der in einer Probe phosphorylierten Rezeptoren berechnet. Während sich diese Arbeit auf die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) konzentriert, kann das Protokoll auf andere Membranrezeptoren und zytosolische Signalmoleküle verallgemeinert werden.
Introduction
Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen 1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenität der Rezeptorphosphorylierung, sowohl im Überfluss als auch in den spezifischen Phosphotyrosinmustern, die ein Mittel zur Manipulation der Signalausgänge bieten können, indem sie die Zusammensetzung des Signalosoms 3,4,5,6,7 diktieren. Es gibt jedoch Einschränkungen in den derzeitigen Methoden zur Abfrage der Proteinphosphorylierung. Die Western-Blot-Analyse eignet sich hervorragend zur Beschreibung von Trends der Proteinphosphorylierung, ist jedoch semi-quantitativ8 und liefert keine Informationen über die Heterogenität des Systems, da Tausende bis Millionen von Rezeptoren zusammen gemittelt werden. Während westliche Blots die Untersuchung einer Probe mit Phospho-spezifischen Antikörpern gegen bestimmte Tyrosine ermöglichen, können sie keine Informationen über Multisite-Phosphorylierungsmuster innerhalb desselben Proteins liefern. Quantitative Phosphoproteomiken berichten über die Phosphotyrosin-Häufigkeit, aber es gibt Einschränkungen beim Nachweis der Multisite-Phosphorylierung, da sich die interessierenden Reste innerhalb desselben Peptids (typischerweise 7-35 Aminosäuren) befinden müssen, das durch enzymatische Verdauung erzeugt wird 9,10,11.
Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde der Einzelmolekül-Pull-Down-Assay (SiMPull) angepasst, um die Phosphorylierungszustände intakter Rezeptoren auf Einzelmolekülebene zu quantifizieren. SiMPull wurde erstmals von Jain et al.12,13 als leistungsfähiges Werkzeug zur Befragung makromolekularer Komplexe demonstriert. In SiMPull wurden makromolekulare Komplexe immunpräzipitiert (IP) auf Antikörper-funktionalisierten Glasdeckgläsern und dann durch Einzelmolekülmikroskopie auf Proteinuntereinheitennummer und Co-IP mit komplexen Komponentenanalysiert 12. Eine Modifikation von Kim et al.14, genannt SiMBlot, war die erste, die eine Variation von SiMPull verwendete, um die Phosphorylierung von denaturierten Proteinen zu analysieren. Das SiMBlot-Protokoll beruht auf der Erfassung biotinylierter Zelloberflächenproteine unter Verwendung von NeutrAvidin-beschichteten Deckgläsern, die dann zur Phosphorylierung mit Phospho-spezifischer Antikörpermarkierunguntersucht werden 14. Trotz dieser Fortschritte waren Verbesserungen erforderlich, um die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikation robuster und auf ein breiteres Spektrum von Proteinen anwendbarer zu machen.
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen optimierten SiMPull-Ansatz, der verwendet wurde, um Phosphorylierungsmuster des intakten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) als Reaktion auf eine Reihe von Ligandenbedingungen und onkogenen Mutationen zu quantifizieren15. Während sich diese Arbeit auf EGFR konzentriert, kann dieser Ansatz auf jeden Membranrezeptor und zytosolische Proteine von Interesse (POI) angewendet werden, für die hochwertige Antikörper verfügbar sind. Das Protokoll umfasst Schritte zur Reduzierung der Probenautofluoreszenz, ein Probenarray-Design, das ein minimales Probenvolumen bei gleichzeitiger Vorbereitung von bis zu 20 Proben erfordert, und die Optimierung der Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen. Datenanalysealgorithmen wurden für den Einzelmolekülnachweis und die Quantifizierung phosphorylierter Proteine entwickelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um quantitative Messungen der Rezeptorphosphorylierung auf Einzelproteinebene zu ermöglichen. Es wurden mehrere einfache, aber wichtige Modifikationen am SiMPull-Protokoll entwickelt, die die Zuverlässigkeit der Messung für den Phospho-Tyrosin-Nachweis verbesserten, einschließlich der Verringerung der Autofluoreszenz mit NaBH4-Behandlung und Nachfixierung der Probe, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern. Die Verwendung der grünen Kanalmaske zur Iden…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 und R01CA248166 zu DSL unterstützt. EMB wurde durch das ASERT-IRACDA-Programm (NIH K12GM088021) und JAR durch das UNM MARC-Programm (NIH 2T34GM008751-20) unterstützt. Wir danken der Verwendung der gemeinsamen Ressource der Fluoreszenzmikroskopie der University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, die von NIH P30CA118100 unterstützt wird. Wir möchten Dr. Ankur Jain und Dr. Taekijip Ha würdigen, deren ursprüngliche Entwicklung von SiMPull diese Arbeit inspiriert hat.
ES-C anwesende Adresse: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
Referencias
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