ヒト肺オルガノイドの確立と近位分化による成熟気道オルガノイドの生成
Summary
このプロトコルは、初代肺組織からヒト肺オルガノイドを誘導し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して、ヒト気道上皮を忠実に表現鏡検査する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成する方法を提示する。
Abstract
ヒト呼吸器上皮の堅牢な インビトロ モデルの欠如は、呼吸器系の生物学および病理学の理解を妨げる。我々は、肺組織中の成体幹細胞からヒト肺オルガノイドを誘導し、近位分化を誘導して成熟気道オルガノイドを生成するための定義されたプロトコールを記述する。その後、肺オルガノイドは高い安定性で1年以上連続して拡張され、分化した気道オルガノイドは、ヒト気道上皮をほぼ生理学的レベルまで形態学的および機能的にシミュレートするために使用される。これにより、ヒト気道上皮の堅牢なオルガノイドモデルを確立した。肺オルガノイドと分化した気道オルガノイドの長期的な拡大は、安定した再生可能な供給源を生成し、科学者が培養皿中のヒト気道上皮細胞を再構築および拡張することを可能にする。ヒト肺オルガノイド系は、ウイルス-宿主相互作用の研究、薬物検査、および疾患モデリングを含む、様々な用途のためのユニークで生理学的に活性な in vitro モデルを提供する。
Introduction
オルガノイドは、臓器発生のインビトロモデリングと生物学と疾患の研究のための堅牢で普遍的なツールとなっています。成長因子で定義された培養培地で培養すると、様々な器官からの成体幹細胞(ASC)を3次元(3D)で増殖させ、オルガノイドと呼ばれる複数の細胞型からなる器官様細胞クラスターに自己組織化することができる。Cleversの研究室は、2009年に最初のASC由来オルガノイドであるヒト腸管オルガノイドの誘導体を報告した1,2。その後、ASC由来オルガノイドは、前立腺3、4、肝臓5、6、胃7、8、9、膵臓10、乳腺11、および肺12,13を含む様々なヒト器官および組織について確立されている。.これらのASC由来オルガノイドは、天然器官の重要な細胞的、構造的、および機能的特性を保持し、長期拡大培養において遺伝的および表現型の安定性を維持した14、15。
オルガノイドはまた、胚性幹(ES)細胞および人工多能性幹(iPS)細胞16を含む多能性幹細胞(PSC)に由来することもできる。PSC由来のオルガノイドは、その確立のために臓器発達のメカニズムを利用するが、ASCは、生理学的組織の自己複製または組織修復中に幹細胞ニッチを模倣する条件を再構築することによって、オルガノイドを形成するように強制され得る。PSC由来オルガノイドは、ASC由来オルガノイドの同等の成熟レベルに達することはできないものの、発生および器官形成を探索するのに好ましいモデルである。PSC由来オルガノイドの胎児様成熟状態、およびこれらのオルガノイドを確立するための複雑さは、成熟組織における生物学および病理学を研究するためのそれらの広範な適用を実質的に妨げる。
ヒト気道は、鼻から末端気管支まで、4つの主要な細胞タイプ、すなわち繊毛細胞、杯細胞、基底細胞、およびクラブ細胞からなる偽層状繊毛上皮とも呼ばれる気道上皮に並んでいる。我々は、Cleversの研究室12,13と共同で、ヒト肺組織からASC由来のヒト肺オルガノイドを樹立した。これらの肺オルガノイドは、1年以上にわたって拡張培地中で連続して拡張される。正確な持続時間は、異なるドナーから得られた異なるオルガノイド系統間で異なる。しかし、天然の気道上皮と比較して、これらの長期拡張可能な肺オルガノイドは、ヒト気道の主要な細胞集団である繊毛細胞がこれらの肺オルガノイドにおいて過小に表現されているため、十分に成熟していない。そこで、近位分化プロトコールを開発し、気道上皮を生理学的に近いレベルまで形態学的および機能的に表現写用する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成しました。
ここでは、一次肺組織からヒト肺オルガノイドを導出し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して3Dおよび2D気道オルガノイドを生成するためのビデオプロトコルを提供する。
Protocol
本明細書に記載のヒト組織を用いた全ての実験は、香港大学/病院局香港西クラスター(UW13-364およびUW21-695)の治験審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントは、組織採取前に患者から得られた。 1. ヒト肺オルガノイドの導出 実験材料の調製 高度DMEM/F12培地に2 mMグルタミン、10 mM HEPES、100 U/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプト?…
Representative Results
このプロトコルは、高い成功率を有するヒト肺オルガノイドの誘導を可能にする。新鮮なヒト肺組織は細かく細かくなり、次いでコラゲナーゼで分解される。得られた単一細胞を地下マトリックスに包埋し、上皮幹細胞の伸長のためのニッチ因子のカクテルを添加した肺オルガノイド膨張培地中でインキュベートする(ステップ1.1.2)。 図1 は、還元増殖因子基底膜マトリ…
Discussion
人間の気道は、偽層状繊毛上皮としても知られる気道上皮で並んでいます。上気道上皮の主な細胞型は、頂端繊毛の協調運動が気道から粘液および吸入粒子を排出することを可能にする繊毛細胞、粘液を産生および分泌する杯細胞、および基底膜に並び再生に関与する基底細胞である。細気管支のような小さな気道では、直方体気道上皮は分泌クラブ細胞を含み、上気道領域よりも繊毛細胞?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、共焦点イメージング及びフローサイトメトリーにおける支援に対し、香港大学李開清医学部パノラマ科学・電子顕微鏡ユニットに感謝する。この研究は、食品衛生局の保健医療研究基金(HMRF、17161272、19180392)からの資金提供によって部分的に支援されました。研究助成審議会の一般研究費(GRF、17105420)Health@InnoHK、イノベーション・テクノロジー委員会、香港特別行政区政府。
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Referencias
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Citar este artículo
Li, C., Chiu, M. C., Yu, Y., Liu, X., Xiao, D., Huang, J., Wan, Z., Zhou, J. Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids. J. Vis. Exp. (181), e63684, doi:10.3791/63684 (2022).