Оценка эффективности фотосинтеза у фотодыхающих мутантов методом флуоресцентного анализа хлорофилла
Summary
Описан подход к измерению изменений эффективности фотосинтеза у растений после обработки низким содержаниемСО2 с использованием флуоресценции хлорофилла.
Abstract
Фотосинтез и фотодыхание представляют собой наибольшие потоки углерода в первичном метаболизме растений и необходимы для выживания растений. Многие из ферментов и генов, важных для фотосинтеза и фотодыхания, были хорошо изучены в течение десятилетий, но некоторые аспекты этих биохимических путей и их перекрестные помехи с несколькими субклеточными процессами еще не полностью поняты. Большая часть работы, которая идентифицировала гены и белки, важные для метаболизма растений, была проведена в строго контролируемых средах, которые могут не лучше всего представлять, как фотосинтез и фотодыхание функционируют в естественной и сельскохозяйственной среде. Учитывая, что абиотический стресс приводит к нарушению эффективности фотосинтеза, необходима разработка высокопроизводительного экрана, который может контролировать как абиотический стресс, так и его влияние на фотосинтез.
Поэтому мы разработали относительно быстрый метод скрининга абиотических стресс-индуцированных изменений эффективности фотосинтеза, который может идентифицировать нехарактеризованные гены с ролями в фотодыхании с использованием флуоресцентного анализа хлорофилла и скрининга с низким содержанием CO2 . В данной работе описан метод изучения изменений эффективности фотосинтеза у нокаутирующих мутантов переносимой ДНК (Т-ДНК) у Arabidopsis thaliana. Этот же метод может быть использован для скрининга мутантов, индуцированных этилметансульфонатом (EMS), или скрининга супрессоров. Использование этого метода может идентифицировать гены-кандидаты для дальнейшего изучения первичного метаболизма растений и абиотических стрессовых реакций. Данные этого метода могут дать представление о функции генов, которая может быть не распознана до воздействия повышенной стрессовой среды.
Introduction
Абиотические стрессовые условия, обычно наблюдаемые на фермерских полях, могут негативно повлиять на урожайность сельскохозяйственных культур, снижая эффективность фотосинтеза. Вредные условия окружающей среды, такие как тепловые волны, изменение климата, засуха и засоление почвы, могут вызывать абиотические стрессы, которые изменяют доступность CO2 и уменьшают реакцию растения на высокий световой стресс. Двумя крупнейшими наземными потоками углерода являются фотосинтез и фотодыхание, которые необходимы для роста растений и урожайности сельскохозяйственных культур. Многие из важных белков и ферментов, участвующих в этих процессах, были охарактеризованы в лабораторных условиях и идентифицированы на генетическом уровне1. Хотя был достигнут большой прогресс в понимании фотосинтеза и фотодыхания, многие этапы, включая транспорт между органеллами растений, остаются нехарактеризованными 2,3.
Фотодыхание, второй по величине поток углерода в растениях после фотосинтеза, начинается, когда фермент Rubisco фиксирует кислород вместо углекислого газа к рибулозе 1,5 бисфосфату (RuBP), генерируя ингибирующее соединение 2-фосфогликолат (2PG)1. Чтобы свести к минимуму ингибирующее действие 2PG и рециркулировать ранее фиксированный углерод, растения C3 развили мультиорганелларный процесс фотодыхания. Фотодыхание превращает две молекулы 2PG в одну молекулу 3-фосфоглицерата (3PGA), которая может повторно войти в цикл фиксации углерода C31. Таким образом, фотодыхание преобразует только 75% ранее зафиксированного углерода из генерации 2PG и потребляет АТФ в процессе. В результате процесс фотодыхания представляет собой значительное 10%-50% сопротивление процесса фотосинтеза в зависимости от наличия воды и температуры вегетационного периода4.
Ферменты, участвующие в фотодыхании, были областью исследований в течение десятилетий, но только небольшое количество транспортных белков было охарактеризовано на генетическом уровне, хотя в процессе 5,6,7 участвует не менее 25 этапов транспорта. Двумя транспортными белками, которые непосредственно участвуют в движении углерода, образующегося в процессе фотодыхания, являются пластидный транспортер гликолята/глицерата PLGG1 и симпортер натрия желчной кислоты BASS6, оба из которых участвуют в экспорте гликолата из хлоропласта 5,6.
В окружающей среде [CO2] Рубиско фиксирует молекулу кислорода к RuBP примерно в 20%случаев 1. Когда растения подвергаются воздействию низкого [CO2], скорость фотодыхания увеличивается, что делает низкий [CO2] идеальной средой для тестирования мутантов, которые могут быть важны при повышенном фотодыхании. Тестирование дополнительных предполагаемых линий Т-ДНК переноса хлоропластов при низком содержании CO2 в течение 24 ч и измерение изменений флуоресценции хлорофилла привело к идентификации линий растений бас-6-1 , которые продемонстрировали фотодыхание мутантного фенотипа5. Дальнейшая характеристика показала, что BASS6 является транспортером гликолята во внутренней мембране хлоропласта.
В этой статье подробно описывается протокол, аналогичный тому, который первоначально использовался для идентификации BASS6 в качестве переносчика фотодыхания, который пришел из списка предполагаемых транспортных белков, расположенных внутри мембраны хлоропласта8 Этот протокол может быть использован в эксперименте с высокой пропускной способностью, характеризующем мутанты Т-ДНК Arabidopsis или мутантные растения, генерируемые EMS, как способ идентификации генов, важных для поддержания эффективности фотосинтеза при ряде абиотических стрессов, таких как тепло, высокий световой стресс, засуха и доступность CO2 . Скрининг растительных мутантов с использованием флуоресценции хлорофилла использовался в прошлом для быстрой идентификации генов, важных для первичного метаболизма9. Поскольку до 30% генома Arabidopsis содержит гены, которые кодируют белки с неизвестной или плохо охарактеризованной функцией, стресс-индуцированный анализ эффективности фотосинтеза может дать представление о молекулярных функциях, не наблюдаемых в контролируемых условиях у мутантных растений10. Целью этого метода является идентификация мутантов фотодыхательного пути с использованием скрининга с низким содержанием CO2 . Представлен метод идентификации мутантов, которые нарушают фотодыхание после воздействия низкого уровня CO2. Преимуществом данного метода является то, что это высокопроизводительный скрининг рассады, который можно сделать за относительно короткий промежуток времени. Разделы видеопротокола содержат подробную информацию о подготовке и стерилизации семян, росте растений и обработке с низким содержаниемCO2 , конфигурации системы флуоресцентной визуализации, измерении квантового выхода обработанных образцов, репрезентативных результатах и выводах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные методы, описанные в этой статье, имеют некоторые преимущества и ограничения. Одним из преимуществ является то, что этот метод может просеивать многие саженцы растений, хотя некоторые меры предосторожности должны быть приняты для предотвращения загрязнения пластины …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Советом регентов Луизианы (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
Referencias
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
