自身免疫性脑炎是一类新的抗体介导的中枢神经系统疾病。海马神经元可用于发现和表征这些抗体。本文提供了原代细胞培养和免疫染色的方案,以确定患者血清和脑脊液中的自身抗体。
在过去的15年中,一类新的抗体介导的中枢神经系统(CNS)疾病已被表征,现在被定义为“自身免疫性脑炎”(AE)。目前有17种已知的AE综合征,并且都与针对神经元细胞表面或突触蛋白的抗体有关。临床综合征很复杂,根据相关抗体的类型而有所不同。这些疾病中最著名的是抗N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎,这是一种与严重记忆和行为障碍相关的突出神经精神疾病。相关抗体在N末端结构域与NMDAR的GluN1亚基反应。最常用于发现和表征AE抗体的方法包括解离的、胎儿的、啮齿动物海马神经元的培养。在抗体表征过程中,培养中的活神经元暴露于患者的血清或脑脊液中,反应性的检测表明患者的血清或脑脊液样本含有针对神经元表面抗原的抗体。海马培养也可用于通过检查患者体内的抗体是否引起神经元的结构或功能改变来确定其是否具有潜在致病性。这些研究的成功程度取决于培养物的质量以及用于获取和检测患者样本反应性的方案。本文为胎鼠海马神经元的原代细胞培养提供了优化的方案,结合免疫染色来确定患者血清或脑脊液中是否存在抗体。还介绍了如何使用培养的神经元和钙成像检查NMDAR抗体的潜在致病作用的示例。
自身免疫性脑炎(AE)是最近发现的一类中枢神经系统(CNS)疾病,由靶向神经元表面或突触蛋白1,2的抗体介导。临床特征因抗体而异,但通常包括记忆和认知受损、行为改变和精神症状、运动异常、睡眠功能障碍、意识水平下降和癫痫发作。这些疾病可影响所有年龄段的个体,某些类型的AE主要影响儿童和年轻人2。
在过去的15年中,已经描述了17种具有针对特定神经元表面/突触蛋白抗体的AE综合征(表1)。神经元靶标的一些例子包括突触兴奋受体NMDAR3,4和AMPAR5,突触抑制受体GABAbR6,神经元分泌蛋白LGI17和细胞粘附分子IgLON58。对于大多数这些AE,研究表明抗体破坏其靶抗原的结构或功能,强烈支持致病作用。例如,在抗NMDAR脑炎中,抗体与NMDAR的GluN1亚基的N末端结构域发生反应,产生这些受体的选择性和可逆内化,导致明显的神经精神改变4,9,10,11。因此,鉴定患者血清或脑脊液中17种已知抗体中的任何一种也可以用作确定特定AE诊断的诊断测试。
更常用于鉴定和表征这些抗体的技术之一包括使用解离的、胎儿的、啮齿动物海马神经元的培养物。这些培养物有用,原因如下:胚胎脑易于解离,含有低水平的神经胶质细胞,这是神经元培养物中污染的主要来源12;与中枢神经系统的大多数其他区域相比,海马体的细胞群相对均匀,金字塔细胞占绝大多数13,14;当锥体神经元的生成完成但颗粒细胞尚未发育时,从晚期胚胎制备培养物,进一步增加了培养物的同质性;培养后,锥体神经元表达其大部分主要表型特征,能够形成发育良好的树突,并建立可用于结构和电生理研究的突触连接网络12,13;由于抗体不能穿透活神经元,因此使用活培养物可以鉴定驻留在细胞表面的抗原靶标;来自神经元培养物的抗体-抗原复合物的免疫沉淀允许鉴定靶抗原5。
使用神经元培养物的研究的成功与否高度依赖于培养物的质量以及用于评估患者血清或脑脊液(CSF)免疫反应性的方案。可能影响培养物的变量包括培养物发育前分离海马体的程序、组织的解离、铺板密度、使用的生长表面以及培养基的组成13、15、16。本文为胎儿大鼠海马神经元的原代细胞培养提供了优化的方案,结合荧光免疫染色,可用于确定针对已知AE抗原和潜在新型表面靶标的抗体的存在。它还提供了一个示例,说明如何使用表达来自GCaMP家族GCaMP5G的遗传编码钙指示剂(GECI)的培养海马神经元的活细胞成像技术检查NMDAR抗体的致病作用。
靶蛋白 | 蛋白质功能 | 细胞隔室 | 主要综合征 |
国家核统计局 | 离子香奈儿 | 突触蛋白 | 抗NMDAR脑炎 |
安帕尔 | 离子香奈儿 | 突触蛋白 | 边缘脑炎 |
谷基K2 | 离子香奈儿 | 突触蛋白 | 脑炎 |
加巴阿 | 离子香奈儿 | 突触蛋白 | 脑炎 |
GABAbR | 代谢受体 | 突触蛋白 | 边缘脑炎 |
mGluR1 | 代谢受体 | 突触蛋白 | 脑炎 |
mGluR2 | 代谢受体 | 突触蛋白 | 脑炎 |
mGluR5 | 代谢受体 | 突触蛋白 | 脑炎 |
D2R | 代谢受体 | 突触蛋白 | 基底神经节脑炎 |
LGI1 | 粘附分子 | 细胞表面蛋白 | 边缘脑炎 |
CASPR2 | 粘附分子 | 细胞表面蛋白 | 边缘脑炎 |
IgLON5 | 粘附分子 | 细胞表面蛋白 | 抗 IgLON5 疾病 |
神经素-3α | 粘附分子 | 细胞表面蛋白 | 脑炎 |
DNER (Tr) | 跨膜蛋白 | 细胞表面蛋白 | 脑炎 |
SEZ6L | 跨膜蛋白 | 细胞表面蛋白 | 脑炎 |
两栖素 | 结构分子 | 细胞表面蛋白 | 边缘脑炎 |
DPPX | 肽酶 | 细胞表面蛋白 | 脑炎 |
表1:针对神经元细胞表面和突触蛋白的抗体。
抗体介导的自身免疫领域的不断发展为鉴定可用于改善患者诊断和治疗的神经元自身抗体打开了一扇机会之窗。海马神经元培养是抗体鉴定的重要工具;因此,执行标准化方案以获得可靠且可重复的结果非常重要。此处讨论了要考虑的最重要步骤、限制和故障排除。
该协议的关键步骤可以分为三类,具体取决于它们是否影响海马神经元的纯度,同质性或活力。
纯度 – 为了获得最佳的原代细胞培养物,研究者必须有信心、训练有素且能够快速工作,特别是要尽量减少解剖时间。即使锥体神经元是主要的细胞类型,海马体也包含多种中间神经元14。为了产生具有最少神经胶质细胞的培养物,必须用最少的周围组织提取海马体。在解剖过程中使用黑色背景有助于在体视显微镜下识别海马体的极限。此外,应该考虑到较低的细胞密度导致旁分泌支持较少,并且使维持培养物更加困难13。因此,重要的是要牢记这种平衡。这在使用少量细胞(每3.5厘米培养皿50,000个神经元)的成像研究中很重要。为了能够有额外的时间进行海马提取,应使用保留组织的冬眠培养基17。使用适当的手术工具也是必不可少的。高精度工具非常精细,因此应通过仔细保护它们来确保技术的可重复性。
均一性 – 为了开发无细胞聚集体的培养物,通过将预拉式玻璃移液器与标准 1,000 μL 移液器结合使用,对机械细胞解离进行了升级。
活力 – 在该协议中,没有添加抗生素,因为它们影响神经元兴奋性并改变培养神经元的电生理特性18。因此,如果不保持最高的无菌标准,很可能受到污染。温度也是一个关键因素。在海马分离期间保持组织冷会减慢新陈代谢并减少细胞降解。因此,将组织保持在冰上,直到细胞解离过程。此外,在酶促细胞解离过程中找到正确的平衡至关重要,该解离使细胞解聚而没有明显的细胞裂解。在该协议中,与胰蛋白酶孵育的时间和随后的洗涤步骤已经过优化,以获得具有足够空间的单个细胞,以允许创建适当的神经元网络。
在神经元培养物的荧光活免疫染色和钙活性记录中也发现了关键步骤。为了进行成功的活免疫染色以确定患者样品中是否存在细胞表面蛋白抗体,必须避免细胞透化,从而使抗体进入细胞内蛋白。此外,根据抗体的滴度,孵育时间和样品稀释度必须相应地调整(例如,非常高滴度的抗体会产生背景染色,这使得解释结果变得困难)。当通过钙成像对自身抗体进行致病性评估时,需要使用最适合细胞活性测量的培养基(例如,培养基中的Mg2+ 抑制对于良好的性能很重要)。此外,对于荧光成像,应避免使用pH指示剂(如酚红)的培养基,因为它会引入非特异性背景信号。
使用海马神经元培养物有两个主要限制。首先,与稳定的细胞系相比,原代培养物必须连续生成,这意味着定期使用实验动物。诱导多能干细胞(iPSC)系可以取代使用动物模型的需求,但iPSC的分化方案仍然不是最佳的。其次,来自iPSC的神经元不表达表面蛋白的完整光谱,因此,如果使用,没有反应性并不一定意味着样品的阴性19。
有三种方法可以筛查疑似AE患者的血清或脑脊液中是否存在自身抗体:使用大鼠脑组织的基于组织的测定(TBA),使用转染的HEK细胞表达神经元蛋白的基于细胞的测定(CBA),以及此处使用海马神经元的活培养物报告的应用19。培养的海马神经元方法的重要性在于它能够区分与TBA不易区分的表面和细胞内抗原的反应性。此外,与HEK转染细胞中的CBA不同,原代神经元培养不受转染蛋白库的限制。此外,培养的海马神经元与免疫沉淀和质谱相结合时可用于鉴定新型抗体及其靶抗原,因此拓宽了可识别抗体的谱。最后,它允许通过可以监测细胞活性改变的实时成像方法评估自身抗体的致病作用。总之,新的自身抗体的鉴定最终能够启动特异性免疫疗法以改善患者的预后。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Merche Rivas,Maria Marsal,Gustavo Castro,Jordi Cortés,Alina Hirschmann和Angel Sandoval(ICFO-Institut de Ciències Fotòniques)和Mercedes Alba,Marija Radosevic,David Soto,Xavier Gasull,Mar Guasp和Lidia Sabater(IDIBAPS,医院,巴塞罗那大学临床医院)的技术支持和试剂,以及Josep Dalmau和Myrna R. Rosenfeld(IDIBAPS, 巴塞罗那大学临床医院)对手稿的批判性审查和指导。这项研究由卡洛斯三世健康研究所(ISCIII)资助,由欧盟、FIS(PI20/00280,JP)、CELLEX基金会(PL-A.)共同资助;Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa R&D Centre for Excellence Centre (CEX2019-000910-S, P.L-A.);CERCA计划和欧洲激光实验室(871124,P.L-A.);科学和创新部(MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033,P.L-A.);和Fondo Social Europeo(PRE2020-095721,M.C.)。
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |