العدوى الفيروسية التجريبية في البعوض البالغ عن طريق التغذية الفموية والحقن المجهري
Summary
هذه المنهجية، التي شملت التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر، يمكن أن تقيم بشكل فعال تأثير حواجز الأمعاء الوسطى و / أو الغدد اللعابية على عدوى الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
Abstract
تنتشر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مسببات الأمراض المعدية للفقاريات ، عن طريق العديد من أنواع البعوض ، مما يشكل تهديدا خطيرا للصحة العامة. بمجرد تناولها ، يجب أن تتغلب الفيروسات على حاجز الأمعاء الوسطى للبعوض للوصول إلى الدملمف ، حيث قد تنتشر إلى الغدد اللعابية. عندما تلدغ البعوضة ، تنتشر هذه الفيروسات إلى مضيفات فقارية جديدة. وبالمثل ، قد تلتقط البعوضة فيروسات مختلفة. بشكل عام ، قد يدخل جزء صغير فقط من الفيروسات الغدد اللعابية عبر الأمعاء. تتأثر كفاءة انتقال هذه الفيروسات إلى الغدد بحاجزين ماديين موجودين في أنواع مختلفة من البعوض: حواجز الأمعاء الوسطى وحواجز الغدد اللعابية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الفيروس في الغدد اللعابية للزاعجة المصرية بعد التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر. علاوة على ذلك ، فإن تحديد ما إذا كانت الأمعاء و / أو الغدد اللعابية تعيق انتشار الفيروس يمكن أن يساعد في تقييم مخاطر MBVs التي تنتقل عن طريق الزاعجة المصرية.
Introduction
يمكن أن تستمر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مجموعة غير متجانسة من فيروسات الحمض النووي الريبي ، في ناقلات البعوض وتنتشر لاحقا إلى مضيفات الفقاريات1. يتم توزيع MBVs المهمة سريريا بشكل رئيسي في أربع عائلات فيروسية ، وهي Flaviviridae و Togaviridae و Reoviridae و Peribunyavividae 2,3. في العقود الأخيرة ، تم الإبلاغ عن هذه الفيروسات في جميع أنحاء العالم ، مما تسبب في مشاكل الصحة العامة. كواحد من أكثر فيروسات MBV المعروفة ، أصبح فيروس حمى الضنك (DENV) أكثر الفيروسات المنقولة بالمفصليات الناشئة أو معاودة الظهور انتشارا في أكثر من 100 دولة خلال السنوات ال 20الماضية 4. منذ اكتشاف فيروس زيكا (ZIKV) في الداخل ، أبلغت جميع البلدان والأقاليم المدارية وشبه المدارية تقريبا في القارة عن حالات عدوى بشرية بفيروسزيكا 5. من أجل تقييم مخاطر انتقال الفيروس ، ركزت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة على كفاءة البعوض الناقل لهذه الفيروسات 6,7. ونتيجة لذلك، من الأهمية بمكان الوقاية من الأمراض المنقولة بالنواقل ومكافحتها بشكل فعال.
الزاعجة المصرية (Ae. aegypti) ، وهي واحدة من أسهل أنواع البعوض التي يسهل تربيتها في المختبر ، هي ناقل مهم لفيروس حمى الضنك ، وفيروس زيكا ، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس الحمى الصفراء (YFV)8. لفترة طويلة ، تم العثور على Ae. aegypti فقط في القارة الأفريقية وجنوب شرق آسيا ، ولكن في السنوات الأخيرة استعمرت جميع القارات تقريبا9. علاوة على ذلك ، فإن الوفرة العالمية ل Ae. aegypti تنمو باستمرار ، مع زيادة تقدر بنحو 20٪ بحلول نهاية القرن10. من عام 2004 إلى عام 2009 في الصين ، كانت هناك زيادة واضحة في كفاءة ناقل Ae. aegypti لفيروس DENV بسبب ارتفاع درجات الحرارة اليومية11. وقد ارتفع وضع Ae. aegypti باعتباره الناقل الممرض ارتفاعا ملحوظا في الصين. وبالتالي ، لمواجهة هذه التحديات ، من الضروري التحقيق في كفاءة ناقلات Ae. aegypti لنقل الفيروسات.
كمفصليات دموية ، تخترق البعوضة الأنثوية جلد مضيف الفقاريات وتتغذى على الدم. يكتسب البعوض أحيانا فيروسات من مضيفين مصابين بالفيروس ثم ينقل الفيروسات إلى مضيف جديد. وعلى هذا النحو، ولتحديد كفاءة النواقل، يتغذى البعوض على مسحوق دم اصطناعي يحتوي على فيروسات مفصلية من خلال نظام تغذية في بيئة المختبر12. يتم فصل البعوض الفردي إلى رؤوس وأجسام وإفرازات لعاب بعد عدة أيام من الإصابة. لقياس معدلات الإصابة بالفيروس وانتشاره وانتقاله ، تم الكشف عن عيار الفيروس عن طريق النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) أو مقايسة البلاك. ومع ذلك ، لا يصاب جميع البعوض بالتهابات الأمعاء الوسطى والقدرة على نقل الفيروس إلى المضيف التالي بعد تغذية الدم. يرتبط بالحواجز الفسيولوجية للبعوض ، والتي تمنع مسببات الأمراض من اختراق الجسم وتلعب دورا حيويا في مناعتها الفطرية13. تؤثر حواجز الأمعاء الوسطى ، وخاصة حاجز عدوى الأمعاء الوسطى (MIB) وحاجز الهروب من الأمعاء الوسطى (MEB) ، على ما إذا كان الفيروس يمكن أن يصيب الناقل بشكل منهجي والكفاءة التي ينتشر بها. إنه يعيق تحليل عدوى الأنسجة الأخرى ، مثل الغدد اللعابية التي تظهر أيضا عدوى الغدد اللعابية وحواجز الهروب13,14. لتوصيف أفضل لعدوى الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية في الناقل ، يتم عرض بروتوكول مفصل للتغذية عن طريق الفم والتلقيح داخل الصدر للفيروس arbovirus في Ae. aegypti هنا. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على حالات عدوى إضافية بالفيروسات المنقولة بالمفصليات في مجموعة متنوعة من ناقلات البعوض، مثل عدوى فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في الزاعجة النيابة، ويمكن أن يثبت أنه إجراء عملي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الهدف من هذه الطريقة هو توفير تقييم شامل لمخاطر فيروس واحد ينقله البعوض من خلال تقييم كفاءة النواقل من خلال التغذية الفموية والتلقيح داخل الصدر.
في تجربة التغذية الفموية ، يجب التقاط البعوض المحتقن ونقله إلى حاوية جديدة ، مما يشكل خطرا شديدا على المشغلين. والسبب في ذلك ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Referencias
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
