이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.
중추 신경계에 노인 세포의 축적이 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 장애에 기여한다는 증거가 있습니다. 세포 노화는 일반적으로 치명적이지 않은 스트레스에 대한 노출에 반응하여 발생하는 영구적 인 세포 주기 정지 상태입니다. 그러나, 다른 비분할 세포와 마찬가지로, 노년기 세포는 대사적으로 활성으로 남아 있으며, 독특한 전사 및 번역 요구와 세포내 및 분비된 프로테옴의 광범위한 변화를 필요로 하는 많은 기능을 수행한다. 노화 동안 단백질 합성과 붕괴율이 어떻게 변하는지 이해하면 세포 노화의 기본 메커니즘을 조명하고 노화 세포에 의해 악화 된 질병에 대한 잠재적 인 치료 방법을 찾을 수 있습니다. 이 논문은 질량 분광법과 조합하여 세포 배양물(pSILAC)에서 아미노산에 의한 펄스 안정한 동위원소 표지를 사용하여 비분할 세포에서 단백질 반감기의 프로테옴 스케일 평가 방법을 기술한다. pSILAC는 아미노산의 안정한 무거운 동위원소 함유 버전을 갖는 세포의 대사 표지를 포함한다. 현대 질량 분광법 접근법과 결합하여, pSILAC는 복잡한 혼합물에서 수백 또는 수천 개의 단백질의 단백질 회전율을 측정할 수 있게 합니다. 대사 표지 후, 단백질의 턴오버 역학은 질량 분광법에 의해 검출된 펩티드에서 무거운 동위원소의 상대적 농축에 기초하여 결정될 수 있다. 이 프로토콜에서는 노인성 섬유아세포 배양물 및 유사하게 정지된 정지 섬유아세포의 생성뿐만 아니라 예상되는 단백질 회전율의 커버리지를 최대화하는 단순화된 단일 시점 pSILAC 라벨링 시간 과정에 대한 워크플로우가 설명됩니다. 또한, pSILAC 질량 분광법 데이터의 분석 및 스프레드 시트를 사용하여 단백질 분해 속도의 사용자 친화적 인 계산을위한 파이프 라인이 제시됩니다. 이 프로토콜의 적용은 노화 세포를 넘어 뉴런과 같은 모든 비분할 배양 세포로 확장될 수 있다.
노화는 먼저 복제 고갈에 도달한 후 배양된 일차 세포에 의해 나타나는 무기한 성장 정지 상태로서확인되었다 1. 그 이후로 노화는 유전 독성, 미토콘드리아 및 발암 유발 스트레스를 포함한 수많은 세포 모욕에 대한 반응으로 발생할 수 있음이 밝혀졌습니다2. 노화 는 종양 억제 및 상처 치유와 같은 몇 가지 생리학적으로 중요한 역할을 하지만, 노화 동안 노화 세포의 축적은 여러 신경 퇴행성 상태4,5,6를포함하여 건강에 해로운 영향을 미치는 호스트와 관련이 있습니다3. 세포 노화 는 뉴런 7,8,9,10, 성상세포(11), 미세아교세포(12), 및 희소돌기아교세포 전구체(13)를 포함하는 다수의 뇌 세포 유형에서 발생하며, 신경변성 및 인지 기능 장애에 기여한다. 알츠하이머 병 14의 특징 중 하나 인 아밀로이드 베타 올리고머는 신경 노화13,15,16을 가속화하는 것으로 나타났습니다. 노화 세포의 증가 된 유병률은 또한 파킨슨 병17, 특히 환경 스트레스 요인11,18에서 발생합니다. 중요하게도, 전임상 모델에서 노인성 세포의 선택적 제거는 수명을 연장하고 다수의 연령 관련 질환(3,5,12)을 완화시키고, 인지 결핍(8,11,12,13)을 개선시킨다. 따라서 노화 세포는 많은 연령 관련 상태의 치료를 위한 유망한 치료 표적으로서 등장하였다.
노화 세포의 해로운 효과의 대부분은 국소 염증, 혈관 형성, 세포외 기질의 파괴 및 주변 조직에서의 노화의 전파를 일으킬 수있는 노화 세포에 의해 분비되는 생리 활성 분자의 복잡한 혼합물 인 노화 관련 분비 표현형 (SASP)에 의해 유발됩니다 19,20,21 . SASP는 또한 세포 주기 정지 상태 동안 상당한 전사 및 번역 노력을 필요로 하기 때문에 노화의 흥미로운 생물학적 현상을 나타낸다. 실제로, 노년기 세포는 단백질 합성을 감소시켜야 하는 리보솜 생물발생 22,23,24의 감소를 나타내는 것으로 나타났다. 대신, 노화 세포는 일부 단백질, 특히 SASP 인자를 견고하게 번역하고 주변 조직25의 신진 대사에 영향을 미칩니다. 따라서, 영구적인 세포 주기 정지를 겪는 노화 세포가 어떻게 단백질 항상성을 계속 유지하면서 동시에 SASP 인자 및 다른 선택된 단백질을 견고하게 발현하는지를 이해하는 데 상당한 관심이 있다.
이 방법은 세포 배양물(pSILAC)에서 아미노산에 의한 질량 분광법 및 펄스 안정한 동위원소 표지를 사용하여 프로테옴 전체 규모로 노인성 세포에서 단백질의 반감기를 전역적으로 측정하는 방법을 설명합니다. 전통적인 SILAC에서, 배양된 세포는 단백질 풍부도의 하류 분석을 위해 아미노산의 무겁고 가벼운 비방사성 동위원소로 완전히 대사적으로 표지된다. 이 방법은 배양된 섬유아세포(26)의 SASP에서 풍부 변화를 포괄적으로 그리고 정량적으로 평가하기 위해 이전에 적용되었다. pSILAC에서, 세포는 가벼운 동위원소로 사전 표지된 다음, 하나 이상의 시간 간격으로 수확되는 무거운 동위원소의 펄스로 유사하게 대사적으로 표지된다. 기존의 경질 동위원소와 관련하여 무거운 동위원소의 혼입 속도는 상대적 단백질 회전율을 계산하는 데 사용됩니다. 일반적으로, 아르기닌 및 리신의 동위원소는 트립신이 이들 잔기에서 절단되기 때문에 사용된다; 따라서, 표준 소화로부터의 모든 펩티드는 잠재적으로 무거운 표지를 함유할 것이다. 무거운 라이신 또는 아르기닌의 존재 또는 부재에 의해서만 상이한 펩티드 쌍은 화학적으로 동일하며 질량 분광계에 의해 분화되고 정량화 될 수있다. 질량 분광분석법 분석 후, 펩티드는 생성된 펩티드 동위원소 표지의 존재 또는 부재에 기초하여 새롭게 합성되거나 기존에 존재하는 것으로 확인될 수 있다. 이어서, 단백질 턴오버 속도는 주어진 단백질에 대한 무거운 (13C-15N) 대 경량 (12C-14N) 펩티드의 비율을 지수 성장 또는 붕괴에 대한 운동 모델27,28에적합시킴으로써 결정될 수 있다. pSILAC는 단백질 회전율 29,30,31,32의 여러 비교에 사용되어 왔으며 현재 단백질 반감기 측정을위한 가장 포괄적이고 높은 처리량 방법입니다.
이 프로토콜은 배양물에서 유사하게 성장-정지된 정지 세포와 병행하여 노화 세포의 제조를 상세히 기술하고, 이어서 pSILAC로 대사 표지를 부착한다. 그런 다음 세포를 수확하고, 용해물로 균질화하고, 질량 분광법 수집 및 분석을 위해 처리한다. 질량 분광법에서 얻은 데이터는 스프레드 시트에서 수행 된 단일 시점 및 반감기 계산을 사용하는 단순화 된 정량적 방법을 사용하여 단백질 반감기를 결정하는 데 사용됩니다. 이 접근법을 사용하여, 단백질 반감기의 추정치는 단백질 합성 또는 턴오버의 차단제를 사용하는 프로토콜보다 교란되지 않은 세포 조건에 더 확실한 포괄적이고 정량적인 방식으로 측정될 수 있다.
pSILAC는 여러 세포 조건에서 단백질 회전율의 글로벌 정량화를 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 이 논문은 노화 및 정동작 세포의 준비, SILAC 라벨링 및 수확, 궁극적으로 DDA 질량 분광법을 사용한 분석을 포함하여 노화 및 정지 세포 사이의 글로벌 단백질 반감기를 비교하기 위해 pSILAC의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 추가적으로, 노화 관련 단백질을 코딩하는 mRNA의 패널의 SA-βGal 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 노화 표현형의 검증을 위한 두 단계 검정이 기술된다. 기술된 두 가지 접근법을 통한 노화의 검증 외에도, 프로테오믹 수준에서 노화 및 정지 세포 사이의 공지된 노화 마커의 변화를 조사함으로써 질량 분광법 분석에 이어 노화의 세 번째 검증을 수행할 수 있다. 상승될 것으로 예상되는 노화-관련 단백질은 p16, p21, 및 BCL2를 포함하며, 다른 것들 중에서도, 다른 곳에서 기술된44,45. 상기 기술된 프로토콜에서, 이온화 방사선은 정지 세포에 대한 노화 및 혈청 기아의 유도를 위해 사용되었다. 노화의 유도를 위해, 이용 가능한 여러 가지 옵션이 있으며, 그들 중 실질적인 이질성이41,42,46이다. 현재 “가장 생리적”으로 간주되는 노화 방법은 없으므로 노인성 유도제의 선택은 주로 실험의 맥락에 기반합니다. 그러나 노화에 대한 일반적인 현상을 진술하는 것을 목표로하는 실험은 적어도 두 개의 다른 노화 유도제를 사용하는 것이 좋습니다. 노화 패러다임의 범위를 논의하는 것은이 논문의 범위를 벗어나지 만, 노화를 유도하는 몇 가지 일반적인 방법에는 DNA 손상 유발 (IR, 독소루비신, 복제 고갈), 발암 단백질 발현 (HRAS, BRAF) 및 미토콘드리아 기능 파괴2가 포함됩니다.
노화 유도제의 선택 이외에, 대조군 세포의 선택은 똑같이 중요한 고려 사항이다. 노인성 세포는 정의에 따라 무기한 성장 정지하에 있으므로 다른 성장 정지 세포와의 비교가 종종 선택됩니다. pSILAC의 경우, 세포 주기 정지된 세포는 복제되지 않고 따라서 단백질 반감기 계산(47)에 사용하기가 더 쉽기 때문에 일반적으로 바람직하다. 그러나, 배양된 세포는 종종 일부 분열 세포를 보유할 것이기 때문에, 세포 주기 정지를 유도하기 위해 사용되는 방법들이 여전히 증식하고 있는 세포로부터의 오류를 최소화하기 위해 가능한 한 동질적인 반응으로서 생산을 정지시키는 것이 중요하다. pSILAC를 사용하여 사이클링 세포에 대한 단백질 분해 속도를 계산하려면 단백질이 딸 세포(27)로 희석되는 속도를 보상하기 위한 추가적인 계산이 필요하다. 그러나 정동작 성장 정지 자체는 합병증이없는 것은 아닙니다. 세포 주기 정지를 위한 두 가지 일반적인 방법이 있다: 혈청 박탈과 접촉 억제(48). 모든 세포가 접촉 억제를 통해 정지될 수 있는 것은 아니지만, 일부 섬유아세포는 배양49일의 며칠 후에 정지를 입증하는 것으로 나타났다. 이 방법은 노인성 세포의 비교에 더 일반적으로 사용되기 때문에 혈청 박탈을 사용했지만, 정확한 비교를 위해 노인 세포가 유사하게 혈청 박탈 될 것을 요구한다. 혈청은 mTOR 복합체를 활성화시키고, 따라서 혈청 박탈은 세포 주기 정지(50) 이외에 세포에 대한 몇 가지 하류 효과를 갖는다. 주목할 만하게, 노년기 세포는 혈청 박탈 또는 mTOR 억제시 감소된 SASP를 나타내는 것으로 나타났다51,52.
pSILAC에서 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 테스트 할 시간 포인트의 수입니다. 이 프로토콜은 단일 시점 (경량 또는 무거운 표지의 3 일)에서 세포를 수집하여 결과 분석을 실질적으로 단순화합니다. 시점의 선택은 실험의 목적을 기반으로해야합니다. 글로벌 분석의 경우 3 일 동안 대부분의 단백질을 포획 할 것으로 예상되지만 3 일 이내에 완전히 회전하는 단기 단백질의 반감기 (모든 빛 신호가 손실됨)는이 시점에서 측정 할 수 없습니다. 반대로, 3 일 동안 회전율이 거의없는 수명이 긴 단백질은 정량화하기가 어렵고 종종 매우 큰 반감기 (주 순서로)를 갖는 것으로 나타나며, 이는 일반적으로 매우 적은 신호 축적의 결과 일뿐입니다. 더 짧고 긴 시점에서, 새로 합성된 단백질의 백분율 대 무거운 펩티드 및 경질 펩티드 신호의 비율에서의 비선형 관계로 인해, 반감기의 정량화는 추가적인 라벨링 시점들을 추가함으로써 개선될 수 있었다. 이 프로토콜에서와 같이 두 세포 상태 간의 상대적 비교를 위해, 대략적인 반감기로 충분할 수 있지만, 정량적 정확도를 향상시키기 위해 추가적인 시간점을 사용할 수 있다.
이 프로토콜은 단백질 회전율의 비표적 DDA 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 그러나, 단백질 턴오버 계산은 일반적으로 무겁고 가벼운 펩티드 쌍의 상대적 풍부도를 유도할 수 있는 임의의 획득 스킴에 적용될 수 있다. 예를 들어, 데이터 독립적 획득(DIA/SWATH)과 같은 MS2-기반 방법들이 또한 성공적으로 회전율(53)의 계산을 위해 적용될 수 있다. 추가적으로, 이 프로토콜에 기술된 것 이외의 계측 및 소프트웨어 파이프라인은 DDA 분석, 단백질 식별 및 단백질 정량화를 수행하는 데 사용될 수 있다. Skyline과 같은 단백질 정량 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 펩티드 피크 영역을 추출하는 경우 문서 작업 공간에서 추출 된 이온 크로마토 그램을 수동으로 검사하고 잘못 통합 된 피크와 비 정량적 피크를 식별하고 그에 따라 문서를 큐레이팅하는 것이 좋습니다. 광범위한 튜토리얼 컬렉션은 스카이 라인 (skyline.ms)에 대한 온라인으로 제공됩니다.
pSILAC는 우수한 멀티플렉싱(프로테옴 커버리지) 및 처리량으로 인해 배양된 세포에서 단백질 반감기의 글로벌 정량화를 위한 가장 이상적인 방법 중 하나를 나타낸다. pSILAC는 합성 또는 분해의 직접적인 속도를 제공하지 않지만, 가볍고 무거운 신호의 변화는 인자의 합류로 인한 것이기 때문에, pSILAC는 조건과 상이한 세포 유형 사이의 비교에 매우 유용하다. 낮은 처리량 방법은 종종 두 가지 유형으로 나뉩니다 : 1) 사이클로헥시미드로 세포를 처리하여 부패를 모니터링하기 위해 첨가 후 시간 간격으로 단백질 합성 및 수확을 차단하거나, 2) 단백질 붕괴 억제제로 세포를 처리하고 단백질 축적을 모니터링하여 단백질 붕괴율을 추론합니다. 두 방법의 한계는 그러한 치료가 필연적으로 세포 생리학에 상당한 변화를 일으킬 것이라는 것입니다. 대조적으로, pSILAC는 실질적인 개입을 필요로하지 않으며 동위원소 아미노산이 그들의 비 동위원소 대응물과 단 하나의 중성자에 의해서만 다르기 때문에 이론적으로 세포 생리학에 검출 가능한 영향을 미치지 않습니다. 따라서, pSILAC에 대해 여기에 기술된 방법은 비분할 세포에서 가장 생리적인 단백질 반감기의 글로벌 측정을 위한 간단한 프로토콜을 나타낸다.
단백질 회전율의 변화는 노화, 연령 관련 질병, 신경 변성 및 장수54,55와 밀접한 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 노화 세포에서 단백질 회전율을 측정하기 위해 세포 배양물에서 아미노산의 안정한 동위원소 표지를 사용하여 이러한 관계를 조사하는 방법을 설명합니다. 그러나, 마우스와 같은 전체 유기체에서 생체 내에서 노화 및 신경 변성의 맥락에서 연구를 수행하기 위해 수많은 유사한 방법이 존재한다. 실제로,이 연구는 연령 관련 질병 56,57,58,59의 맥락에서 단백질 회전율을 측정하는 것이 중요하다는 것을 강조했습니다.
이 연구에서, 소포체에 상주하는 리보솜 단백질과 단백질은 각각 노년기 세포에서 반감기가 감소하고 증가한 두 가지 범주의 단백질로 두드러졌다. 확실한 결론을 내리기 위해서는 정상 상태 수준의 추가 분석이 필요하지만, 이러한 결과는 노쇠한 세포가 리보솜 단백질의 반감기 감소를 통해 번역을 고유하게 조절할 수 있음을 시사합니다. 앞으로, 마우스 모델 에서 생체 내에서 세포 노화와 신경변성 사이의 관계를 연구하기 위해 안정한 동위원소 표지 접근법을 적용하는 것은 이러한 프로토콜에 의해 설명된 동위원소 표지 접근법의 유망한 확장이 될 것이다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIH (National Institutes of Health)와 IRP (Intramural Research Program), National Institute on Aging (NIA)의 지원을 받았습니다. N.B.는 Longevity Impetus Grants와 Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program의 지원을 받았습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
Formic Acid | Sigma | 27001 | |
Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
Urea | ThermoFisher | 29700 | |
Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |