Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique
Summary
Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.
Abstract
Afin de déchiffrer les mécanismes moléculaires complexes qui régulent l’assemblage et le désassemblage des filaments d’actine, il est un grand atout de surveiller les réactions individuelles en direct dans des conditions bien contrôlées. Pour ce faire, des expériences en direct à filament unique ont émergé au cours des 20 dernières années, principalement en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF), et ont fourni une mine de résultats clés. En 2011, afin d’élargir davantage les possibilités de ces expériences et d’éviter des artefacts problématiques récurrents, nous avons introduit une microfluidique simple dans ces essais. Cette étude détaille notre protocole de base, où les filaments d’actine individuels sont ancrés par une extrémité à la surface de la couverture passivée, s’alignent sur l’écoulement et peuvent être exposés successivement à différentes solutions protéiques. Nous présentons également les protocoles pour des applications spécifiques et expliquons comment des forces mécaniques contrôlées peuvent être appliquées, grâce à la traînée visqueuse de la solution fluide. Nous soulignons les mises en garde techniques de ces expériences et présentons brièvement les développements possibles basés sur cette technique. Ces protocoles et explications, ainsi que la disponibilité actuelle d’équipements microfluidiques faciles à utiliser, devraient permettre aux non-spécialistes de mettre en œuvre ce test dans leurs laboratoires.
Introduction
L’assemblage et le démontage des filaments d’actine et des réseaux de filaments d’actine sont contrôlés par plusieurs réactions biochimiques et dépendent du contexte mécanique. Afin de mieux comprendre ces mécanismes complexes, il est inestimable de pouvoir observer des réactions individuelles sur des filaments individuels (en nombre suffisant). Au cours des dernières décennies, l’observation des filaments d’actine dynamiques en temps réel, principalement à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), est devenue une technique clé et a fourni une liste impressionnante de résultats qui n’auraient pas pu être obtenus avec des tests biochimiques en solution en vrac1.
Pour ce faire, il faut maintenir des filaments d’actine marqués par fluorescence près de la surface du couvercle du microscope tout en les exposant à des solutions de protéines de liaison à l’actine (ABP), qui peuvent également être marquées par fluorescence. Cela permet de surveiller les événements qui se produisent sur des filaments individuels dans des conditions biochimiques bien contrôlées et de quantifier ainsi les taux de réaction. Cependant, un certain nombre de limitations spécifiques devraient être prises en compte. Maintenir artificiellement les filaments près de la surface, souvent grâce à plusieurs points d’ancrage ou en utilisant un agent d’encombrement tel que la méthylcellulose, peut modifier leur comportement (par exemple, provoquer des pauses dans leur polymérisation et leur dépolymérisation2). Le suivi du contour de chaque filament peut être difficile, en particulier si de nouveaux filaments ou fragments de filament s’accumulent dans le champ de vision au fil du temps. Les réactions ont lieu dans un volume fini où la concentration de monomères d’actine et d’ABP peut varier au fil du temps, ce qui peut rendre difficile la détermination de constantes de vitesse précises. Enfin, le renouvellement ou la modification de la solution d’ABP est difficile à réaliser en moins de 30 s et conduira souvent à une teneur en protéines inhomogène dans l’échantillon.
Il y a un peu plus de 10 ans, inspirés par ce qui a déjà été fait pour étudier les brins individuels d’acide désoxyribonucléique (ADN)3, nous avons introduit une nouvelle technique basée sur la microfluidique pour observer et manipuler des filaments d’actine individuels4. Il permet de contourner les limitations susmentionnées des techniques classiques à filament unique. Dans ces essais microfluidiques, les filaments d’actine sont cultivés à partir de graines de spectrine-actine adsorbées sur le couvercle. Les filaments sont ainsi ancrés par une extrémité uniquement au fond de la chambre microfluidique et fluctuent au-dessus de la surface sans coller. Les filaments s’alignent sur le flux des solutions entrantes, ce qui facilite la surveillance de leur longueur de contour et les maintient dans une région peu profonde au-dessus de la glissière de couverture où le TIRF peut être utilisé. Différentes solutions sont simultanément acheminées dans la chambre sans mélange, et les filaments peuvent y être exposés séquentiellement et rapidement.
Ici, nous proposons une série de protocoles de base pour mettre en place des tests microfluidiques à filament d’actine unique en laboratoire. Les couvercles et les chambres microfluidiques peuvent être préparés à l’avance (en une demi-journée), et l’expérience elle-même, où plusieurs conditions biochimiques peuvent être testées, est réalisée en moins d’une journée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport aux méthodes standard à filament unique où les filaments d’actine sont ancrés à la surface par plusieurs points le long de leur longueur ou maintenus à proximité de celle-ci par un agent d’encombrement tel que la méthylcellulose, la microfluidique offre un certain nombre d’avantages. Comme les interactions avec la surface sont minimes, les pauses artificielles que ces interactions peuvent induire pendant l’allongement et la dépolymérisation sont évitées. Les filaments sont alignés par l?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à B. Ladoux et R.-M. Laboratoire Mège pour l’utilisation de leur équipement de nettoyage UV, et J. Heuvingh et 0. du Roure pour la formation initiale que nous avons reçue sur la préparation de moules sur plaquettes de silicium et fournissant des conseils sur la microfluidique. Nous reconnaissons le financement de la subvention StG-679116 du Conseil européen de la recherche (à A.J.) et des subventions de l’Agence nationale de la recherche Muscactin et Conformin (à G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
Referencias
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