Dit artikel presenteert een protocol voor de vorming van microtubule-assemblages in de vorm van tactoïden met behulp van MAP65, een plantaardige microtubule crosslinker, en PEG als een crowding agent.
Het cytoskelet is verantwoordelijk voor grote interne organisatie en reorganisatie binnen de cel, allemaal zonder een manager om de veranderingen te sturen. Dit is vooral het geval tijdens mitose of meiose, waarbij de microtubuli de spil vormen tijdens de celdeling. De spil is de machinerie die wordt gebruikt om genetisch materiaal te scheiden tijdens celdeling. Om zelfgeorganiseerde spindels in vitro te creëren, hebben we onlangs een techniek ontwikkeld om microtubuli te reconstitueren tot spindelachtige assemblages met een minimale set microtubuli-geassocieerde eiwitten en verdringingsmiddelen. Specifiek werd MAP65 gebruikt, een antiparallel microtubule crosslinker van planten, een homoloog van Ase1 van gist en PRC1 van zoogdierorganismen. Deze crosslinker organiseert zelf microtubuli in lange, dunne, spindelachtige microtubuli zelfgeorganiseerde assemblages. Deze assemblages zijn ook vergelijkbaar met vloeibare kristal tactoïden, en microtubuli kunnen worden gebruikt als mesoschaal mesogenen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van deze microtubule tactoïden, evenals voor het karakteriseren van de vorm van de assemblages met behulp van fluorescentiemicroscopie en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching.
Celdeling via mitose is een van de belangrijkste biologische processen om het leven in stand te houden. De microtubule filamenten, samengesteld uit tubuline dimeren, zijn essentiële structurele elementen van dit proces. De voorbijgaande machinerie die in de metafase wordt gecreëerd wanneer de chromosomen in het celcentrum worden uitgelijnd, wordt de mitotische spindel genoemd vanwege zijn vorm, die lijkt op een spindel van een weefgetouw bedekt met draden (figuur 1A). Het is bij veel organismen goed ingeburgerd dat microtubuli in de metafase worden gebruikt om gecondenseerde chromosomen in het midden van de cel te duwen en te trekken, ze uit te lijnen en ze aan te sluiten op microtubuli die ze in de anafase uit elkaar zullen trekken (figuur 1B, C). De spindel vormt zich in zowel meiose (figuur 1B) als mitose (figuur 1C), ontstaan uit vele overlappende microtubuli die niet als draad om de centrale as zijn gewikkeld, maar parallel aan de interface lopen. Het creëren van deze op microtubuli gebaseerde structuren vereist geassocieerde eiwitten die crosslinken en geassocieerde enzymen die kunnen fungeren als motoren om de chromosomen te duwen en te trekken1.
Studies van meiotische spindels hebben aangetoond dat de microtubuli kort, dynamisch en overlappend zijn in crosslinked arrays 2,3,4,5,6 (Figuur 1Di). Door de fysische organisatie van deze korte microtubuli is de meiotische spindel vergelijkbaar met een vloeibaar kristal tactoïde (figuur 1E). Van spindels is inderdaad aangetoond dat ze samensmelten en samensmelten, zoals men zou verwachten van vloeibare kristaltatoïden5.
Veel studies die dateren uit de jaren 1960 hebben fixatie, seriële secties en elektronenmicroscopie gebruikt om te bepalen dat er twee soorten microtubuli in de mitotische spindel 7,8,9,10 zijn. Het eerste type wordt de kinetochore microtubuli genoemd, die de spindelpool verbinden met het kinetochore. Het tweede type wordt de interpolaire of polaire microtubuli genoemd, die voorbij de chromosomen groeien en elkaar overlappen in de midzone (figuur 1Dii)8,9,10. Een derde type wordt de astrale microtubuli genoemd, die zich buiten de spil bevinden en de polen verbinden met de celrand; deze microtubuliorganisaties vallen buiten het bestek van de huidige discussie. Er zijn recente studies geweest naar de interactie tussen augmin6 en gamma-tubuline ringcomplex dat nucleatiecentra voor microtubuli beïnvloedt, wat resulteert in een mitotische spindel met kortere microtubuli zoals in figuur 1D.
Omdat microtubuli langer zijn dan ze breed zijn, met een hoge beeldverhouding en hoge stijfheid, zijn ze als opgeschaalde versies van vloeibare kristalmoleculen. In de fysica van zachte materie zijn atomen en moleculen benaderd met behulp van minimale interacties om de fysische mechanismen van faseovergangen af te leiden, waaronder nucleatie en het smelten van kristallen11. Evenzo zijn microtubuli mesoschaalobjecten die opgeschaalde versies zijn van vloeibare kristalmoleculen, die inzicht geven in de fysica van vloeibare kristaldynamica, inclusief de nucleatie en groei van de nematische fasen van isotrope fasen. Verder, zoals hierboven besproken, vertoont de meiotische spindel eigenschappen zoals die van een vloeibaar kristal tactoïde, een nematische toestand die nucleeert en groeit uit de isotrope toestand van vloeibare kristalmoleculen 3,4,5. Voor tactoïden zijn nucleatie en groei vergelijkbaar met die van andere kristallen (d.w.z. een relatief hoge concentratie mesogenen vereisen [de moleculen die vloeibare kristallen vormen]). De unieke “spindel” vorm van de tactoïde komt van de lokale uitlijning van de vloeibare kristal mesogenen die uitlijnen in de nematische fase (figuur 1E). Ze kunnen geen afgerond kristal vormen omdat de moleculen zeer asymmetrisch zijn. Gezien de aard van de microtubuli is het misschien niet verwonderlijk dat de mitotische spindelmachinerie gemaakt van een hoge lokale concentratie microtubuli ook dezelfde vorm heeft, of het nu een tactoïde of een spindel wordt genoemd. Tactoïden kunnen bipolair zijn, met polen aan de taps toelopende uiteinden (figuur 1Ei), of homogeen, met polen effectief op oneindig (figuur 1Eii).
Gezien het belang van spindelvorming, zijn er inspanningen geleverd voor zelfgeorganiseerde spindelvorming in vitro door microtubulecondensatie in bundels aan te tonen via ionische soorten12,13, verdringingsmiddelen die uitputtingsinteracties creëren14,15, en specifieke microtubule crosslinking eiwitten 13,16,17,18,19, 21. Verrassend genoeg, hoewel deze middelen allemaal werken om de lokale concentratie van microtubuli te verhogen, resulteren ze vaak in lange microtubulibundels, maar niet in tactoïden. Een reden waarom deze bundels lang zijn, zou kunnen zijn dat de microtubuli waaruit ze bestaan ook lang zijn. Recent werk met kortere microtubuli meldde ook langere bundels die aan het einde niet taps toelopend zijn15; in dit geval worden de bundels bij elkaar gehouden met motoreiwitten die verlenging van de bundels veroorzaken en daardoor langer maken. Korte microtubuli met niet-extensiele crosslinkers zijn nodig voor taps toelopende, spindelachtige assemblages, zoals hier beschreven.
Onlangs hebben we een techniek ontwikkeld om de creatie van microtubule tactoïden mogelijk te maken met behulp van de antiparallel crosslinker, MAP65, in de aanwezigheid van nucleating stabiele microtubules22. De microtubuli moesten kort zijn, maar weinig bekende regulatoren van microtubulilengte kunnen microtubuli afdekken tegen dynamische instabiliteit of end-to-end gloeien. In plaats daarvan werd GMPCPP gebruikt om de filamenten na groei te nucleeren en te stabiliseren. Dit maakte het mogelijk om een hoge dichtheid van korte microtubuli te creëren die zichzelf konden organiseren in tactoïden. Deze tactoïden waren homogeen wanneer ze onder birefringence werden bekeken. Naast korte microtubuli werd een specifieke antiparallel crosslinker, MAP65, gebruikt om de tactoïden te vormen (figuur 2). MAP65 is een plantaardig microtubule-geassocieerd eiwit in de PRC1/Ase1 familie van mitotische crosslinkers23. MAP65 bestaat als een dimeer, met een sterke affiniteit om aan zichzelf te binden, evenals de microtubuli24. In tegenstelling tot de meiotische spindel en tactoïden waargenomen met actinefilamenten 25,26,27, die bipolair zijn en de vloeistofachtige eigenschappen van vloeibare kristallen hebben, zijn microtubuli tactoïden waargenomen als vast-achtig22,28.
Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van de microtubule tactoïden en het karakteriseren van de vorm van de assemblages en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van op fluorescentie gebaseerde technieken.
De hier beschreven methoden zijn in verschillende artikelen gebruikt om microtubuli tactoïden te maken (figuur 2)22,28. Deze experimenten zijn biologisch relevant om de organisatieprincipes te helpen ontdekken die de vorm en stabiliteit van de mitotische of meiotische spindel in de meeste celtypen beheersen. Bovendien zijn microtubuli model vloeibare kristal mesogenen die kunnen helpen bij het leren van meer over hoe vloeibare kristallen nucleate en groeien nematische fasen uit isotrope fasen.
De hier beschreven procedure heeft verschillende voordelen voor het verkennen van microtubule zelforganisatie. Ten eerste is het zeer reproduceerbaar, omdat het in het lab is uitgevoerd door veel studenten, waaronder middelbare scholieren, met weinig voorkennis of training voordat ze in het lab begonnen. De tactoïden zijn birefringent22, waardoor ze naast fluorescentiemicroscopie ook in doorgelaten licht kunnen worden bekeken, waardoor deze methode toegankelijk is voor veel laboratoria en deze experimentele procedure kan worden aangepast aan educatieve doeleinden, naast hoogwaardig onderzoek. Ten slotte opent dit proces wegen om biologische systemen te blijven begrijpen en onderzoeken in een uitgeklede, reductionistische benadering, waardoor men kan begrijpen hoe elke aanvullende aandoening, eiwit of additief de zelforganisatie van tactoïden en, misschien, uiteindelijk, de spil kan veranderen. Doelen voor betere biomimicry zijn activiteit, vloeibaarheid en filamentpolariteitssortering.
Er kunnen verschillende factoren zijn die van invloed zijn op het experiment en onverwachte resultaten opleveren. Als de tactoïden zich bijvoorbeeld niet vormen (figuur 2) maar waaierachtige patronen worden waargenomen, is de MAP65 waarschijnlijk niet aanwezig of niet bindend aan de microtubuli22,28. Dit zou ook duidelijk moeten zijn in het MAP65-fluorescentiekanaal, omdat de GFP-MAP65 niet gebonden is aan de microtubuli.
Als de tactoïden zich niet vormen en de achtergrond als spikkels op het glas verschijnt, kan dit te wijten zijn aan de oppervlaktecoating. Eenmaal uitgevoerd, duurt de silanisatie slechts 1 maand op coverslips. Wanneer het slijt, kan de tubuline zich niet-specifiek aan het blootgestelde oppervlak binden. Deze binding zal in vreemde patronen plaatsvinden.
Als de tactoïden zich niet vormen en de tubuline wordt waargenomen in aggregaten van verschillende vormen en maten, kan dit te wijten zijn aan tubuline van slechte kwaliteit. Tubuline kan worden gecentrifugeerd om initiële aggregaten te verwijderen die deze off-pathway aggregatie kunnen aansturen in plaats van microtubule polymerisatie. Als het oppervlak zich aan de tubuline bindt, kan het ook de tubuline in de oplossing uitputten. Lage concentraties tubuline, onder de kritische concentratie voor het polymeriseren van microtubuli, kunnen resulteren in aggregaten.
In FRAP-experimenten, als het MAP65-kanaal geen herstel vertoont (figuur 5), is het mogelijk dat de fotobleaching de microtubuli fotode. Fotoschade veroorzaakt de gelokaliseerde vernietiging van de filamenten. Dit kan worden gecontroleerd door onderzoek in het zendkanaal. Microtubule tactoïden zijn zichtbaar in het overgedragen kanaal door een hoge brekingsindex die niet overeenkomt met het omringende water. Door licht geïnduceerde fotoschade zal verschijnen als een brandmerk of verlies van contrast in doorgelaten lichtbeeldvorming op de locatie van de ROI die wordt blootgesteld aan fotobleaching. Als dit gebeurt, moet de laser- of lichtkracht worden verminderd om de fotoschade van de eiwitten te remmen.
Er waren verschillende uitdagingen in deze procedure en aanpak. Een probleem is dat de lengtemetingen momenteel met de hand worden uitgevoerd door op de afbeelding te klikken. Deze methode, hoewel eenvoudig, kan leiden tot grote onzekerheid. De breedtemeting die de doorsnede gebruikt en past bij een Gauss is een betere methode om de grootte te kwantificeren. Een vergelijkbare methode zou kunnen worden gebruikt voor de lengte. Een tweede probleem is dat de tactoïden, omdat ze zo lang en dun zijn, soms kunnen buigen. Dit maakt het kwantificeren van de lengte moeilijker. De contourlengte kan worden gekwantificeerd met behulp van een gesegmenteerde lijn, maar er is extra onzekerheid telkens wanneer een segment wordt toegevoegd.
Vanuit een wetenschappelijk perspectief heeft deze benadering enkele andere uitdagingen voor het gebruik ervan als model voor vloeibare kristallen of spindels. De eerste uitdaging was de lange, dunne vorm van de tactoïden die microtubuli creëren (figuur 3 es figuur 4). Zoals opgemerkt in eerdere publicaties22, zijn microtubule tactoïden homogene tactoïden, niet bipolair. Dit betekent dat de microtubuli waaruit de vorm bestaat, zich niet heroriënteren om naar de uiteinden van de structuur te wijzen. In plaats daarvan zijn alle microtubuli evenwijdig aan de lange as en bevinden de “polen” zich op oneindig. Dit is heel anders dan de tactoïden die worden waargenomen voor moleculaire vloeibare kristallen of zelfs voor actine of DNA dat ook kan fungeren als vloeibare kristal mesogenen. In deze andere systemen zijn de tactoïden bipolair en, wanneer ze worden bekeken in gekruiste polarisatoren, vertonen ze de veelbetekenende tekenen van heroriëntatie van de staven.
Een tweede grote uitdaging in dit systeem is dat de microtubuli onbeweeglijk zijn in de tactoïde. Dit blijkt duidelijk uit FRAP-experimenten en -analyse omdat het herstel van de microtubuli zeer laag is. Hun vaste aard maakt microtubuli tactoïden minder waardevol dan grootschalige vloeibare kristalanalogen. De nematische fase van een vloeibaar kristal moet zowel vloeibare (vloeistof) als kristal (georganiseerde) eigenschappen hebben. Hoewel de vorm goed lijkt voor de spindel, maakt de immobiliteit het systeem minder opwindend als een model mitotische spindel. Aan de andere kant biedt dit probleem mogelijkheden om te onderzoeken hoe men de experimenten kan aanpassen om meer vloeibaarheid in het systeem te creëren.
Deze wetenschappelijke uitdagingen bieden spannende kansen die nieuwe kennis over het systeem mogelijk maken. Om de microtubuli tactoïden meer bipolair te maken, zou men kortere microtubuli kunnen gebruiken. Er is echter een extra uitdaging, omdat microtubuli niet veel goed gekarakteriseerde capping-eiwitten hebben om de lengte te beheersen zoals actine dat doet. Het gebruik van nucleatie en groei vereist het gebruik van zeer hoge concentraties tubuline en GMPCPP om korte microtubuli te maken. De hoge tubulineconcentratie resulteert in een groter aantal filamenten in het systeem, waardoor het moeilijker wordt om tactoïden van elkaar te scheiden. De toevoeging van nieuwe microtubule cappers, zoals DARPin33, kan helpen bij deze situatie. Het tweede probleem dat de microtubuli onbeweeglijk zijn, kan worden verzacht door de toevoeging van motoreiwitten, zoals kinesine-534, tetrameren van motoren die bij mitose worden gebruikt. Als alternatief kunnen kunstmatige dimeren van dimerische kinesine-1 worden gebruikt15.
Een andere manier om meer vloeibaarheid toe te voegen, zou zijn om de microtubuli hun dynamische instabiliteit te laten uitvoeren, het groeien en krimpen van microtubuli. Momenteel zijn microtubuli die worden bezaaid met stabiele GMPCPP-filamenten en vervolgens dynamische instabiliteit ondergaan, veel langer dan gewenst om een spindel of tactoïde te vormen, wat zou resulteren in zeer lange organisaties zoals fans of bundels. Het toevoegen van microtubule dynamische instabiliteit zou dus zorgvuldig moeten worden gedaan om de tactoïde vorm te behouden. De toevoeging van geassocieerde eiwitten en enzymen die de lengte kunnen regelen, kan dit probleem verminderen. Bijvoorbeeld, het depolymeriseren van kinesines, zoals kinesine-1335, of het scheiden van enzymen, zoals katanine36, zou waarschijnlijk nodig zijn. Deze experimenten zijn complex en moeilijk, hoewel ze zeer inzichtelijk zouden zijn, ongeacht wat de resultaten onthullen. Welke richting toekomstige experimenten ook opgaan, het hier ontwikkelde platform voor het maken van microtubule tactoïden kan nieuwe informatie blootleggen op de fysieke basis van microtubule organisatie.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen alle leden van het Ross Lab in de zomer van 2021, in het bijzonder K. Alice Lindsay, bedanken voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NSF BIO-2134215 die S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee en J.L. Ross ondersteunde. Een subsidie van de KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) ondersteunde R. Branch en P. Chauhan gedeeltelijk
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |