Summary

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP’lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC’ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP’ların ve MuSC’lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

Abstract

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP’ler), fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy boyunca farklılaşabilen iskelet kası yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin (MSC’ler) bir popülasyonudur. Kas kök hücreleri (MuSC’ler) ile birlikte FAP’lar, hücre dışı matrisi (ECM) aktif olarak korurken ve yeniden şekillendirirken, kas homeostazı, onarımı ve yenilenmesinde kritik bir rol oynar. Kronik hasar ve kas distrofileri gibi patolojik durumlarda, FAP’lar anormal aktivasyona uğrar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak fibroz ve kas içi yağ infiltrasyonuna yol açar. Bu nedenle, FAP’lar kas rejenerasyonunda, MuSC döngüsünü sürdürerek ve doku onarımını teşvik ederek veya iskelet kası dokusunun bütünlüğünü ve işlevini tehlikeye atan fibrotik skar oluşumuna ve ektopik yağ infiltrasyonlarına katkıda bulunarak ikili bir rol oynamaktadır. FAP ve MuSC’lerin uygun şekilde saflaştırılması, bu hücrelerin fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rolünü anlamak için bir ön koşuldur. Burada, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak FAP’ların ve MuSC’lerin yetişkin farelerin uzuv kaslarından eşzamanlı izolasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, mononüklee hücrelerin tüm ekstremite kaslarından ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından mekanik ve enzimatik ayrışmasını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. FAP’lar ve MuSC’ler daha sonra saf hücre popülasyonları elde etmek için yarı otomatik bir hücre sıralayıcısı kullanılarak izole edilir. Ek olarak, sessiz ve aktif FAP’ları ve MuSC’leri tek başına veya kokültür koşullarında kültürlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz.

Introduction

İskelet kası, yetişkin insan ağırlığının ~% 40’ını oluşturan vücuttaki en büyük dokudur ve duruşun korunmasından, hareket üretilmesinden, bazal enerji metabolizmasının düzenlenmesinden ve vücut ısısından sorumludur1. İskelet kası oldukça dinamik bir dokudur ve mekanik stres, metabolik değişiklikler ve günlük çevresel faktörler gibi çeşitli uyaranlara uyum sağlama konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Ek olarak, iskelet kası akut yaralanmaya yanıt olarak yenilenir ve morfolojisinin ve fonksiyonlarının tamamen restorasyonuna yol açar2. İskelet kası plastisitesi, esas olarak, miyofiber plazma zarı ile bazal lamina 2,3 arasında yer alan uydu hücreleri olarak da adlandırılan yerleşik kas kök hücrelerinin (MuSC’ler) popülasyonuna dayanır. Normal koşullar altında, MuSC’ler kas nişinde sessiz bir durumda bulunur, hücresel ciroyu telafi etmek ve kök hücre havuzunu yenilemek için sadece birkaç bölümvardır 4. Yaralanmaya yanıt olarak, MuSC’ler hücre döngüsüne girer, çoğalır ve ya yeni kas liflerinin oluşumuna katkıda bulunur ya da kendini yenileme sürecinde nişe geri döner 2,3. MuSC’lere ek olarak, iskelet kasının homeostatik bakımı ve yenilenmesi, fibro-adipojenik progenitörler (FAP’ler) olarak adlandırılan bir kas yerleşik hücre popülasyonunun desteğine dayanır5,6,7. FAP’lar kas bağ dokusuna gömülü mezenkimal stromal hücrelerdir ve fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy 5,8,9,10 boyunca farklılaşabilir. FAP’lar, kas kök hücre nişinde hücre dışı matriks proteinlerinin bir kaynağı oldukları için MuSC’ler için yapısal destek sağlar. FAP’lar ayrıca sitokinler ve miyogenez ve kas büyümesi için trofik destek sağlayan büyüme faktörleri salgılayarak iskelet kasının uzun süreli bakımını teşvik eder 6,11. Akut kas hasarı üzerine, FAP’lar yenilenen kasın yapısal bütünlüğünü destekleyen ve MuSC’lerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını parakrin bir şekilde sürdürmek için elverişli bir ortam sağlayan geçici bir niş üretmek için hızla çoğalırlar5. Rejenerasyon ilerledikçe, FAP’lar apoptoz ile rejeneratif kastan temizlenir ve sayıları yavaş yavaş bazal seviye12’ye geri döner. Bununla birlikte, kronik kas hasarını destekleyen koşullarda, FAP’lar pro-apoptotik sinyallemeyi geçersiz kılar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak ektopik yağ infiltrasyonlarına ve fibrotik skar oluşumuna yol açan kas nişinde birikir12,13.

Çok etkili olmaları ve rejeneratif yetenekleri nedeniyle, FAP’lar ve MuSC’ler iskelet kası bozukluklarının tedavisinde rejeneratif tıpta prospektif hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, fonksiyonlarını ve terapötik potansiyellerini araştırmak için, FAP ve MuSC’lerin izolasyonu ve kültürü için etkili ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak önemlidir.

Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), boyut ve granülerlik gibi morfolojik özelliklere dayanarak farklı hücre popülasyonlarını tanımlayabilir ve hücre yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş antikorların kullanımına dayalı olarak hücreye özgü izolasyona izin verir. Yetişkin farelerde, MuSC’ler vasküler hücre adezyon molekülü 1’i (VCAM-1, CD106 olarak da bilinir) 14,15 ve α7-Integrin15’i ifade ederken, FAP’lar trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü α (PDGFRa) ve kök hücre antijeni 1’i (Sca1 veya Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 olarak ifade eder. . Burada açıklanan protokolde MuSC’ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olarak tanımlanırken, FAP’lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olarak tanımlanmıştır. Alternatif olarak, PDGFRαEGFP fareleri, FAP’ları CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları18,19 olarak izole etmek için kullanıldı. Ayrıca, PDGFRa-GFP + hücrelerinin floresan sinyali ile yüzey belirteci Sca1 tarafından tanımlanan hücreler arasındaki örtüşmeyi karşılaştırdık. Analizimiz, GFP eksprese eden tüm hücrelerin Sca1 için de pozitif olduğunu gösterdi, bu da her iki yaklaşımın da FAP’ların tanımlanması ve izolasyonu için kullanılabileceğini gösterdi. Son olarak, spesifik belirteç antikorları ile boyama, her hücre popülasyonunun saflığını doğruladı.

Protocol

Yapılan tüm hayvan deneyleri, Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, yerel hayvan etiği kurallarına uymalıdır. NOT: Bu protokol, FAP’ların ve MuSC’lerin yetişkin erkek ve dişi farelerin (3-6 ay) arka ekstremite ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından nasıl izole edileceğini ayrı…

Representative Results

Bu protokol, yaklaşık bir milyon FAP’ın ve 350.000’e kadar MuSC’nin vahşi tip yetişkin farelerin (3-6 ay) yaralanmamış arka bacaklarından izole edilmesine izin verir, bu da FAP’lar için% 8’lik bir verime ve toplam olayların MuSC’leri için% 3’lük bir verime karşılık gelir. Yaralanmadan 7 gün sonra hasarlı TA’dan hücreleri ayırırken, sırasıyla% 11 ve% 4’lük bir verime karşılık gelen 300.000 FAP ve 120.000 MuSC’ye kadar elde etmek için iki ila üç TA kası toplanır. Sıralama sonrası saflık de…

Discussion

Saf yetişkin kök hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izolasyonu için etkili ve tekrarlanabilir protokollerin oluşturulması, işlevlerini anlamaya yönelik ilk ve en kritik adımdır. İzole FAP’lar ve MuSC’ler, kas hastalıkları için potansiyel bir tedavi olarak transplantasyon deneylerinde multiomik analiz yapmak için kullanılabilir veya kök hücre tedavisinde hastalık modellemesi için genetik olarak değiştirilebilir.

Burada açıklanan protokol, yetişkin farelerin a…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MuSC izolasyonu konusundaki tavsiyeleri için Tom Cheung’a (Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIAMS-IRP tarafından NIH hibeleri AR041126 ve AR041164 aracılığıyla finanse edildi.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

Referencias

  1. Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
  2. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  3. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  4. Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  6. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  7. Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
  8. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  9. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  10. Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
  11. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
  12. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  13. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
  14. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  15. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
  16. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
  17. Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
  18. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  19. Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
  20. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
  21. Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
  22. García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  23. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  24. Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  25. Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Biología del desarrollo. 326 (1), 47-59 (2009).

Play Video

Citar este artículo
Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

View Video