포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대
Summary
암 면역 요법 시대에, 종양 미세 환경 역학을 밝히는 것에 대한 관심이 눈에 띄게 증가했습니다. 이 프로토콜은 염색 및 이미징 단계와 관련하여 질량 분광법 이미징 기술을 자세히 설명하므로 고도로 다중화 된 공간 분석이 가능합니다.
Abstract
면역 기반 치료법의 발전은 암 치료 및 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이것은 종양 면역 풍경의 특성화에 대한 수요 증가를 촉발시켰다. 표준 면역 조직 화학은 조직 아키텍처를 연구하는 데 적합하지만 소수의 마커 분석으로 제한됩니다. 반대로, 유세포 분석기와 같은 기술은 조직 형태학에 대한 정보가 손실되지만 동시에 여러 마커를 평가할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 표현형 및 공간 분석을 통합하는 다중화 전략이 종양 면역 풍경의 특성화에 대한 포괄적 인 접근법으로 부상했습니다. 여기에서는 분석 개발 및 최적화, 조직 준비 및 이미지 획득 및 처리의 기술적 단계에 중점을 둔 금속 표지 항체와 이차 이온 질량 분광법을 결합한 혁신적인 기술에 대해 논의합니다. 염색하기 전에 금속 표지 항체 패널을 개발하고 최적화해야합니다. 이 하이플렉스 이미지 시스템은 단일 조직 섹션에서 최대 40개의 금속 태그가 지정된 항체를 지원합니다. 참고로, 신호 간섭의 위험은 패널에 포함된 마커의 수에 따라 증가합니다. 패널 설계 후, 이러한 간섭을 최소화하기 위해 항체에 대한 금속 동위원소 할당에 특별한주의를 기울여야한다. 예비 패널 검사는 항체의 작은 서브셋 및 대조군 조직에서 전체 패널의 후속 검사를 사용하여 수행된다. 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직 절편을 얻어 금 코팅 슬라이드에 장착하고 추가로 염색한다. 염색은 2 일이 걸리며 표준 면역 조직 화학 염색과 매우 유사합니다. 샘플이 염색되면 이미지 수집 장비에 배치됩니다. 시야가 선택되고 이미지가 수집, 업로드 및 저장됩니다. 마지막 단계는 시스템의 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 간섭을 필터링하고 제거하기위한 이미지 준비입니다. 이 플랫폼의 단점은 분석 소프트웨어가 부족하다는 것입니다. 그러나 생성 된 이미지는 다른 계산 병리학 소프트웨어에 의해 지원됩니다.
Introduction
클론 종양 집단을 둘러싼 수많은 세포 유형의 중요성은 발암 분류에 중요한 요소입니다. 이러한 종양 미세환경(TME) 조성 및 상호작용을 해명하는 것에 대한 관심은 암 치료 무기고의 일부로서 면역-기반 요법의 확립 이후 지속적으로 증가하였다. 따라서, 치료 전략은 종양 중심 접근법에서 TME 중심 접근법1로 이동하였다.
종양 감시 및 암 발생에서 면역 세포의 역할을 밝히려는 노력은 최근 몇 년 동안 눈에 띄게 증가했습니다 2,3. 의학 연구에서, 세포 측정 기반 방법과 단일 플렉스 및 멀티플렉스 이미징 기술을 포함한 많은 방법이 TME의 여러 요소의 고유 한 상호 작용을 해독하려는 시도의 일환으로 발생했습니다.
유세포 분석기 (1960 년대에 발명 됨), 형광 활성화 세포 분류 및 질량 세포 측정과 같은 선구적인 방법은 주로 TME 성분4를 확인하고 정량화하는 데 중점을 둡니다. 세포측정법 기반 정량적 기술이 면역 풍경 표현형을 허용하더라도, 세포 공간 분포를 결정하는 것은 불가능하다. 반대로, 표준 단일플렉스 면역조직화학과 같은 방법은 조직 구조를 보존하고 연구자들이 세포 분포를 분석할 수 있게 하지만, 단일 조직 절편에서 표적의 수가 감소하는 것은 이러한 방법의 한계이다 5,6. 지난 몇 년 동안, 멀티플렉스 면역형광, 바코딩 형광 이미징 및 이미징 질량 분광법과 같은 단일 세포 분해능을 위한 멀티플렉스 이미징 기술은 동일한 조직 섹션7을 사용하여 동시 마커 염색에 대한 정보를 획득하기 위한 포괄적인 전략으로 부상하였다.
여기에서는 금속 태깅된 항체와 이차 이온 질량 분광법을 결합하고 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 및 신선한 냉동(FF) 조직 샘플8,9를 이용한 단일 세포 분해능 정량화, 마커 공동발현(표현형) 및 공간 분석을 가능하게 하는 기술을 제시합니다. FFPE 샘플은 조직 보관 샘플에 가장 널리 사용되는 재료이며, 신선한 냉동 샘플(10)보다 멀티플렉스 이미징 기술에 대해 더 쉽게 이용가능한 자원을 나타낸다. 또한이 기술은 몇 달 후 이미지를 다시 획득 할 수있는 가능성을 제공합니다. 여기에서, FFPE 조직 샘플을 사용하는 우리의 염색 및 이미지 처리 프로토콜에 대해 논의한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TME의 여러 구성 요소 간의 복잡하고 복잡한 상호 작용에 대한 포괄적 인 해명은 암 연구의 중추적 인 목표로 남아 있습니다. 제조업체는 이러한 노력의 일환으로 특히 지난 5 년 동안 수많은 다중 분석을 도입했습니다. 다중화 공간 분석은 종양 샘플에서 구조적 형태를 보존하면서 여러 표적의 동시 분류를 용이하게하는 다재다능하고 강력한 도구입니다. 공간 분석 기술은 본원에 기재된 기술(<sup …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 기사를 편집한 MD 앤더슨의 연구 의학 도서관인 편집 서비스(Editing Services)의 돈 노우드(Don Norwood)와 MD 앤더슨(MD Anderson)의 번역 분자 병리학과의 멀티플렉스 면역형광 및 이미지 분석 연구소(Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory)를 인정한다. 이 간행물은 부분적으로 국립 암 연구소 (NCI) 협력 협약 (U24CA224285)을 통해 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 암 면역 모니터링 및 분석 센터 (CIMAC)에 제공된 암 면역 모니터링 및 분석 센터 – 암 면역 데이터 커먼즈 네트워크 (CIMAC-CIDC)에 대한 과학적 및 재정적 지원에 의해 촉진 된 연구에서 비롯되었습니다.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
Referencias
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