Экспериментальная модель иммунотерапии меланомы с использованием вакцинации против опухоли с помощью кроветворного цитокина
Summary
В протоколе представлена модель иммунотерапии рака с использованием клеточной вакцинации опухоли с Flt3L-экспрессирующей меланомой B16-F10. Этот протокол демонстрирует процедуры, включая подготовку культивируемых опухолевых клеток, имплантацию опухоли, облучение клеток, измерение роста опухоли, выделение внутриопухолевых иммунных клеток и анализ проточной цитометрии.
Abstract
Fms-подобный тирозинкиназа 3 лиганд (Flt3L) представляет собой кроветворный цитокин, который способствует выживанию и дифференцировке дендритных клеток (DC). Он был использован в опухолевых вакцинах для активации врожденного иммунитета и усиления противоопухолевых реакций. Этот протокол демонстрирует терапевтическую модель с использованием клеточной опухолевой вакцины, состоящей из Flt3L-экспрессирующих клеток меланомы B16-F10 вместе с фенотипическим и функциональным анализом иммунных клеток в микроокружении опухоли (TME). Описаны процедуры культивируемой подготовки опухолевых клеток, имплантации опухоли, облучения клеток, измерения размера опухоли, выделения внутриопухолевых иммунных клеток и анализа проточной цитометрии. Общей целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии солидной опухоли и исследовательской платформы для изучения взаимосвязи между опухолевыми клетками и инфильтрирующими иммунными клетками. Протокол иммунотерапии, описанный здесь, может быть объединен с другими терапевтическими методами, такими как блокада иммунных контрольных точек (анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-PD-L1 антитела) или химиотерапия с целью улучшения терапевтического эффекта меланомы.
Introduction
Иммунотерапия рака была признана многообещающей терапевтической стратегией, основанной на ее менее токсичных побочных эффектах и более длительных ответах. Было разработано несколько типов иммунотерапии, включая онколитическую вирусную терапию, противораковые вакцины, цитокиновую терапию, моноклональные антитела, перенос приемных клеток (CAR-T-клетки или CAR-NK) и блокаду иммунных контрольных точек1.
Для противораковых вакцин существуют различные формы терапевтических вакцин, такие как цельноклеточные вакцины, белковые или пептидные вакцины и РНК- или ДНК-вакцины. Вакцинация опирается на способность антигенпрезентирующих клеток (АПК) обрабатывать опухолевые антигены, включая опухолеспецифические антигены, и представлять их в иммуногенной форме Т-клеткам. Дендритные клетки (ДК), как известно, являются наиболее мощными АПК и, как полагают, играют важную роль в противоопухолевом иммунитете 2,3. Эти клетки поглощают и обрабатывают опухолевые антигены, а затем мигрируют в дренирующие лимфатические узлы (dLN), чтобы праймировать и активировать опухолеспецифические Т-эффекторные (Teff) клетки путем вовлечения рецептора Т-клеток (TCR) и костимуляторных молекул. Это приводит к дифференцировке и расширению опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток (CTL), которые проникают в опухоль и убивают опухолевые клетки4. Следовательно, активация и созревание ДК представляют собой привлекательные стратегии для стимуляции иммунитета против опухолевых антигенов.
Известно, что Flt3L способствует созреванию и расширению функционально зрелых DC, которые экспрессируют белки MHC класса II, CD11c, DEC205 и CD865. Было показано, что внутриопухолевое, но не внутривенное введение вектора аденовируса, включающего ген Flt3L (Adv-Flt3L), способствует иммунной терапевтической активности в отношении ортропотопических опухолей6. Flt3L также используется в вакцинах на основе опухолевых клеток, состоящих из облученных клеток B16-F10, стабильно экспрессирующих ретровирусно трансдуцированный Flt3L в качестве способа усиления перекрестной презентации опухолевых антигенов ДК и, таким образом, увеличения противоопухолевых ответов. Протокол вакцинации против опухоли B16-Flt3L, описанный здесь, основан на исследовании, опубликованном группой7 доктора Джеймса Эллисона. В этой статье они сообщили, что вакцина B16-Flt3L в сочетании с блокадой CTLA-4 синергетически индуцировала отторжение установленной меланомы, что приводило к увеличению выживаемости.
Целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии меланомы. Здесь подробно описаны процедуры того, как приготовить и имплантировать опухолевые вакцины, а также как проанализировать состав и функцию внутриопухолевых иммунных клеток из солидной опухоли.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, основан на исследовании группы Эллисон. Они продемонстрировали, что комбинация вакцины B16-Flt3L с блокадой CTLA-4 показала синергетический эффект на выживаемость и рост опухоли, тогда как у мышей, получавших вакцину B16-Flt3L или лечение антителами против CTLA-4…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Стивена Шёнбергера за предоставление клеток B16-Flt3L и персоналу лаборатории цитометрии животных и проточной цитометрии LJI за отличную поддержку.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
Referencias
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
