Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica

Summary

Aqui, desenvolvemos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip para replicar a cepa biomecânica in vivo de células musculares lisas na parede da aorta humana.

Abstract

Técnicas convencionais de cultura de células bidimensionais e modelos animais têm sido utilizados no estudo do aneurisma e dissecção da aorta torácica humana (TAAD). No entanto, o TAAD humano às vezes não pode ser caracterizado por modelos animais. Há uma aparente lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais que podem dificultar a descoberta de drogas terapêuticas. Em contraste, o modelo convencional de cultura celular é incapaz de simular estímulos biomecânicos de vivo. Para este fim, a microfabricação e as técnicas microfluídicas se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que replicam o microambiente biomecânico. Neste estudo, um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) foi desenvolvido para simular os parâmetros fisiopatológicos da biomecânica da aorta, incluindo a amplitude e a frequência da tensão cíclica experimentada pelas células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) que desempenham um papel vital no TAAD. Nesse modelo, a morfologia dos CMHHs tornou-se alongada, alinhada perpendicularmente à direção da deformação e apresentou fenótipo mais contrátil em condições de deformação do que em condições convencionais estáticas. Isso foi consistente com a orientação celular e o fenótipo nas paredes aórticas humanas nativas. Além disso, usando TAAD (BAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) e HASMCs primários derivados de TAAD (TAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica tricúspide, estabelecemos modelos de doença BAV-TAAD e TAV-TAAD, que replicam as características do HASMC no TAAD. O modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro que é complementar aos modelos animais para explorar ainda mais a patogênese do TAAD e descobrir alvos terapêuticos.

Introduction

O aneurisma e dissecção da aorta torácica (DAAT) é uma dilatação ou delaminação localizada da parede aórtica associada a alta morbidade e mortalidade¹. As células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) desempenham um papel vital na patogênese do TAAD. Os HASMCs não são células terminalmente diferenciadas, e os HASMCs retêm alta plasticidade, permitindo que eles mudem fenótipos em resposta a diferentes estímulos². As CMSAP são submetidas principalmente à tensão de tração rítmica in vivo, sendo este um dos principais fatores reguladores das alterações morfológicas, diferenciação e funções fisiológicas do músculo liso ^3,4. Portanto, o papel da cepa cíclica no estudo das CMHS não pode ser ignorado. No entanto, as culturas convencionais de células 2D não podem replicar a estimulação biomecânica da cepa cíclica experimentada pelos HASMCs in vivo. Além disso, a construção de um modelo de TAAD animal não é adequada para alguns tipos de TAAD, como o TAAD relacionado à válvula aórtica bicúspide (BAV). Além disso, a lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais não pode ser ignorada. Dificulta a tradução farmacêutica na prática clínica. Assim, há uma necessidade urgente de sistemas mais complexos e fisiológicos para simular o ambiente biomecânico in vivo na pesquisa de doenças da aorta.

Experimentos com animais usados em pesquisa biomédica e desenvolvimento de medicamentos são caros, demorados e eticamente questionáveis. Além disso, os resultados de estudos em animais frequentemente não conseguem prever os resultados obtidos em ensaios clínicos em humanos ^5,6. A falta de modelos pré-clínicos humanos e a alta taxa de falha em ensaios clínicos têm resultado em poucos medicamentos eficazes para a clínica, o que tem aumentado os custos com a assistência à saúde⁷. Assim, é urgente encontrar outros modelos experimentais que complementem os modelos animais. As técnicas de microfabricação e microfluídica se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que corrigem as desvantagens das técnicas tradicionais de cultura de células 2D e estabelecem um modelo in vitro mais realista, de baixo custo e eficiente para estudos fisiológicos e desenvolvimento de medicamentos. Usando dispositivos microfluídicos, os órgãos em chips são estabelecidos para cultivar células vivas em câmaras do tamanho de micrômetros com diferentes estímulos para replicar as principais funções de um tecido ou órgão. O sistema consiste em microcanais microfluídicos únicos ou múltiplos, com um tipo de célula cultivada em uma câmara perfundida replicando funções de um tipo de tecido ou diferentes tipos de células cultivadas em membranas porosas para recriar interfaces entre diferentes tecidos. Os organoides microfluídicos combinados com células derivadas de pacientes têm a vantagem única de preencher a grande diferença de espécies entre os modelos de doenças de camundongos e humanos e superar as desvantagens da cultura tradicional de células 2D para pesquisa de mecanismos de doenças e descoberta de medicamentos. Com o rápido desenvolvimento da microfluídica nos últimos anos, os pesquisadores perceberam a utilidade de modelos in vitro organ-on-a-chip (OOC) replicando parâmetros biológicos complexos in vivo ⁸. Esses organoides microfluídicos simulam ambientes biomecânicos in vitro, como deformação cíclica, tensão de cisalhamento e pressão líquida, proporcionando um ambiente de cultura celular tridimensional (3D). Até o momento, vários modelos de OCO foram estabelecidos para simular estímulos biomecânicos em órgãos como o pulmão⁹, rim 10, fígado 11, intestino^{12 e coração 13,} mas estes não têm sido amplamente aplicados ao estudo da doença aórtica humana.

Neste estudo, apresentamos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) que pode controlar as forças mecânicas biomiméticas e os ritmos aplicados aos HASMs primários derivados de pacientes com TAAD. O chip consiste em placas espessas de três camadas de polidimetilsiloxano (PDMS) gravadas com canais e duas membranas PDMS altamente flexíveis comercializadas. Os HASMCs são cultivados nas membranas do PDMS. O canal no meio do chip é preenchido com um meio de cultura para cultura celular. Os canais superior e inferior do chip são conectados a um sistema de fornecimento de pressão de vácuo que pode controlar o ritmo e a frequência da tensão de tração mecânica das membranas PDMS. A deformação rítmica experimentada pelos HASMCs pode ser simulada no HASMC-OOC, replicando o microambiente biomecânico de tecido ou órgão não funcionalmente alcançável com sistemas de cultura 2D convencionais. Com a vantagem de imagens de alta resolução, em tempo real e microambiente biomecânico, as atividades bioquímicas, genéticas e metabólicas das células vivas podem ser estudadas para o desenvolvimento de tecidos, fisiologia de órgãos, etiologia da doença, mecanismos moleculares e identificação de biomarcadores, doenças cardiovasculares e doenças da aorta. Combinado com células específicas de tecidos e pacientes, esse sistema pode ser usado para triagem de drogas, medicina personalizada e testes de toxicidade. Este modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro para estudar a patogênese da doença aórtica.

Protocol

Espécimes aórticos humanos foram utilizados para isolamento primário do HASMC sob a aprovação do Hospital Zhongshan, Comitê de Ética da Universidade de Fudan (NO. B2020-158). Espécimes de aorta foram coletados de pacientes submetidos à cirurgia de aorta ascendente no Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os pacientes antes da participação. 1. Isolamento primário das células musculares lisas da aorta humana…

Representative Results

O modelo HASMC-OOC consiste em um sistema de controle de vácuo, um sistema circulante e chips PDMS, e o projeto esquemático do modelo HASMC-OOC (Figura 1). O sistema de controle de vácuo consiste em uma bomba de vácuo, válvulas solenoides e um controlador PLC. Para atuar como o sistema circulante, uma bomba peristáltica foi usada para refrescar o meio de cultura celular e adicionar drogas. O chip PDMS foi composto por duas câmaras de vácuo e uma câmara média preenchida com SMCM par…

Discussion

Com o rápido desenvolvimento da tecnologia microfluídica, modelos OOC que podem replicar a função biológica e a estrutura de um ou mais órgãos in vitro surgiram nos últimos anos para aplicações em biologia, medicina e farmacologia¹⁵. A OCO pode simular funções-chave do microambiente fisiológico humano, essenciais para explorar os mecanismos da doença e promover a tradução pré-clínica de medicamentos ^8,16. Embora …

Materials

4% paraformaldehyde	Beyotime	P0099-100ml	Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0408	Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025-20g
Calcium AM/PI	Invitrogen	L3224
Cell culture flask	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
Commercial flexible PDMS membrane	Hangzhou Bald Advanced Materials	KYQ-200
F-actin	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
Hoses	Runze Fluid	96410	1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth muscle cell line CRL1999	ATCC	Lot Number:70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download: https://fiji.sc	Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Luer	Runze Fluid	RH-M016	Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope	Olympus
mouse collagen	Sigma	C7661
Oxygen plasma	Changzhou Hongming Instrument	HM-Plasma5L
Pasteur pipette	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
peristaltic pump	Kamoer	F01A-STP-B046
Petri dish	Corning	430167
PLC controller	Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory	BR010-11T8X2M	The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	Cat 1101
solenoid valve	SMC (China)	VQZ300
Syringe	Becton,Dickinson and Company	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	To penetrate cell membranes
Trizol	Invitrogen	10296010	Used for RNA extraction
trypsin	Sigma	15400054
vacuum filter	SMC (China)	ZFC5-6	Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump	Kamoer	KVP15-KL-S
vacuum regulator	AirTAC	GVR-200-06
Primers
Primer Name	Forward (5’ to 3’)	Reverse (5’ to 3’)
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA