تقدم هذه الورقة البروتوكولات خطوة بخطوة لطفرات كريسبر / كاس 9 لذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية. ستكون الخطوات التفصيلية التي يوفرها هذا البروتوكول الموحد بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للدراسات الجينية الوظيفية في B. dorsalis.
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات شديدة التوغل والتكيف التي تسبب أضرارا للحمضيات وأكثر من 150 محصولا آخر من محاصيل الفاكهة في جميع أنحاء العالم. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة وتضع الإناث بيضها تحت جلود الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة عادة ما يكون أداؤها ضعيفا في الحقل. مع تطور الأدوات البيولوجية الجزيئية وتكنولوجيا التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العديد من العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات. وتشمل هذه RNAi أو مبيدات الآفات القائمة على تحرير الجينات التي تقلل من تنظيم أو إسكات الجينات (الأهداف الجزيئية) ، مثل الجينات الشمية المشاركة في سلوك البحث ، في الآفات الحشرية المختلفة. لتكييف هذه الاستراتيجيات لمكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة للبحث الجيني الوظيفي. تعمل الجينات ذات الوظائف الحاسمة في بقاء وتكاثر B. dorsalis كأهداف جزيئية جيدة لضربة قاضية للجينات و / أو إسكاتها. نظام كريسبر / كاس 9 هو تقنية موثوقة تستخدم لتحرير الجينات ، وخاصة في الحشرات. تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر كريسبر / كاس 9 لبكتيريا B. dorsalis ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. ستكون هذه البروتوكولات بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات الحشرية العالمية التي تسبب أضرارا لأكثر من 150 نوعا من محاصيل الفاكهة ، بما في ذلك الجوافة والمانجو و Eugenia spp. وكرز سورينام والحمضيات وإسكدنيا والبابايا1. تقدر الأضرار الناجمة في مقاطعة قوانغدونغ (الصين) وحدها بأكثر من 200 مليون يوان. تقوم الإناث البالغات بإدخال بيضها تحت جلد الثمار الناضجة أو الناضجة ، مما يتسبب في تسوس الثمار وانقطاعها ، مما يقلل من جودة الثمار والمحصول الإجمالي للمحصول2. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة ويرقاتها تثقب في جلد الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة تؤدي أداء ضعيفا في الحقل. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الاستخدام المكثف للمبيدات الحشرية إلى زيادة مقاومة B. dorsalis ضد المواد الكيميائية الزراعية المختلفة ، مما يجعل السيطرة على هذه الآفات الضارة أكثر صعوبة3. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات فعالة وصديقة للبيئة لإدارة الآفات.
في الآونة الأخيرة ، مع تطوير الأدوات البيولوجية الجزيئية وتقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات ، مثل RNAi ، التي تستهدف وظائف الجينات المهمة (الأهداف الجزيئية) لمختلف الآفات الحشرية. يمكن تحديد الجينات التي تعتبر حاسمة لبقاء الآفة وتكاثرها من خلال الدراسات الجينية الوظيفية وتعمل أيضا كأهداف جزيئية محتملة لتحسين أدوات إدارة الآفات المستهدفة والصديقة للبيئة على وجه التحديد4. لتكييف مثل هذه الاستراتيجيات مع مكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة لأبحاث الجينات الوظيفية.
تم اكتشاف نظام CRISPR / Cas (متجمع بانتظام بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة ب CRISPR) في البداية في البكتيريا والعتائق ووجد أنه آلية تكيفية تشارك في التعرف على الحمض النووي الأجنبي داخل الخلايا وتدهوره ، مثل تلك التي يتم إدخالها عن طريق إصابة البكتيريا5. في نظام كريسبر من النوع الثاني ، يتم توجيه النوكلياز الداخلي Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط (crRNA و tracrRNA) لشق الحمض النووي6،7،8 وأصبح أحد أكثر الأدوات استخداما لتحرير الجينات حتى الآن9،10،11،12. نظرا لأن نظام CRISPR / Cas9 يتمتع بالعديد من المزايا ، مثل الكفاءة العالية لإسكات الجينات والتكلفة المنخفضة ، فقد تم تطبيقه بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات ، بما في ذلك Aedes aegypti 13,14 و Locusta migratoria15 و Bombyx mori16. في B. dorsalis ، تم التخلص بنجاح من الجينات المتعلقة بلون الجسم ، وإزدواج شكل الجناح ، وتحديد الجنس باستخدام CRISPR / Cas917،18،19. ومع ذلك ، فإن الإجراءات التفصيلية لتطبيق CRISPR / Cas9 في هذه الحشرة لا تزال غير مكتملة. علاوة على ذلك ، فإن بعض الخطوات التي قدمها الباحثون لتحرير جين B. dorsalis متنوعة أيضا وتحتاج إلى توحيد قياسي. على سبيل المثال ، كانت أشكال Cas9 مختلفة في المراجع المنشورة17،18،19.
تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر B. dorsalis باستخدام نظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. سيكون هذا البروتوكول بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
نظام CRISPR / Cas9 هو أداة تحرير الجينات الأكثر استخداما وله تطبيقات مختلفة ، مثل الجينات threpy30 ، وتربية المحاصيل 31 ، والدراسات الأساسية لوظائف الجينات32. تم تطبيق هذا النظام بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات وكان بمثابة أداة فعالة للدراسات ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Shenzhen للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272) والصناديق الخاصة للابتكار في مجال تكنولوجيا العلوم والتنمية الصناعية لمنطقة Shenzhen Dapeng الجديدة (رقم المنحة. PT202101-02).
6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |