بروتوكولات كريسبر / كاس 9 طفرات ذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية
Summary
تقدم هذه الورقة البروتوكولات خطوة بخطوة لطفرات كريسبر / كاس 9 لذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية. ستكون الخطوات التفصيلية التي يوفرها هذا البروتوكول الموحد بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للدراسات الجينية الوظيفية في B. dorsalis.
Abstract
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات شديدة التوغل والتكيف التي تسبب أضرارا للحمضيات وأكثر من 150 محصولا آخر من محاصيل الفاكهة في جميع أنحاء العالم. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة وتضع الإناث بيضها تحت جلود الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة عادة ما يكون أداؤها ضعيفا في الحقل. مع تطور الأدوات البيولوجية الجزيئية وتكنولوجيا التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العديد من العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات. وتشمل هذه RNAi أو مبيدات الآفات القائمة على تحرير الجينات التي تقلل من تنظيم أو إسكات الجينات (الأهداف الجزيئية) ، مثل الجينات الشمية المشاركة في سلوك البحث ، في الآفات الحشرية المختلفة. لتكييف هذه الاستراتيجيات لمكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة للبحث الجيني الوظيفي. تعمل الجينات ذات الوظائف الحاسمة في بقاء وتكاثر B. dorsalis كأهداف جزيئية جيدة لضربة قاضية للجينات و / أو إسكاتها. نظام كريسبر / كاس 9 هو تقنية موثوقة تستخدم لتحرير الجينات ، وخاصة في الحشرات. تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر كريسبر / كاس 9 لبكتيريا B. dorsalis ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. ستكون هذه البروتوكولات بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
Introduction
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات الحشرية العالمية التي تسبب أضرارا لأكثر من 150 نوعا من محاصيل الفاكهة ، بما في ذلك الجوافة والمانجو و Eugenia spp. وكرز سورينام والحمضيات وإسكدنيا والبابايا1. تقدر الأضرار الناجمة في مقاطعة قوانغدونغ (الصين) وحدها بأكثر من 200 مليون يوان. تقوم الإناث البالغات بإدخال بيضها تحت جلد الثمار الناضجة أو الناضجة ، مما يتسبب في تسوس الثمار وانقطاعها ، مما يقلل من جودة الثمار والمحصول الإجمالي للمحصول2. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة ويرقاتها تثقب في جلد الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة تؤدي أداء ضعيفا في الحقل. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الاستخدام المكثف للمبيدات الحشرية إلى زيادة مقاومة B. dorsalis ضد المواد الكيميائية الزراعية المختلفة ، مما يجعل السيطرة على هذه الآفات الضارة أكثر صعوبة3. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات فعالة وصديقة للبيئة لإدارة الآفات.
في الآونة الأخيرة ، مع تطوير الأدوات البيولوجية الجزيئية وتقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات ، مثل RNAi ، التي تستهدف وظائف الجينات المهمة (الأهداف الجزيئية) لمختلف الآفات الحشرية. يمكن تحديد الجينات التي تعتبر حاسمة لبقاء الآفة وتكاثرها من خلال الدراسات الجينية الوظيفية وتعمل أيضا كأهداف جزيئية محتملة لتحسين أدوات إدارة الآفات المستهدفة والصديقة للبيئة على وجه التحديد4. لتكييف مثل هذه الاستراتيجيات مع مكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة لأبحاث الجينات الوظيفية.
تم اكتشاف نظام CRISPR / Cas (متجمع بانتظام بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة ب CRISPR) في البداية في البكتيريا والعتائق ووجد أنه آلية تكيفية تشارك في التعرف على الحمض النووي الأجنبي داخل الخلايا وتدهوره ، مثل تلك التي يتم إدخالها عن طريق إصابة البكتيريا5. في نظام كريسبر من النوع الثاني ، يتم توجيه النوكلياز الداخلي Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط (crRNA و tracrRNA) لشق الحمض النووي6،7،8 وأصبح أحد أكثر الأدوات استخداما لتحرير الجينات حتى الآن9،10،11،12. نظرا لأن نظام CRISPR / Cas9 يتمتع بالعديد من المزايا ، مثل الكفاءة العالية لإسكات الجينات والتكلفة المنخفضة ، فقد تم تطبيقه بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات ، بما في ذلك Aedes aegypti 13,14 و Locusta migratoria15 و Bombyx mori16. في B. dorsalis ، تم التخلص بنجاح من الجينات المتعلقة بلون الجسم ، وإزدواج شكل الجناح ، وتحديد الجنس باستخدام CRISPR / Cas917،18،19. ومع ذلك ، فإن الإجراءات التفصيلية لتطبيق CRISPR / Cas9 في هذه الحشرة لا تزال غير مكتملة. علاوة على ذلك ، فإن بعض الخطوات التي قدمها الباحثون لتحرير جين B. dorsalis متنوعة أيضا وتحتاج إلى توحيد قياسي. على سبيل المثال ، كانت أشكال Cas9 مختلفة في المراجع المنشورة17،18،19.
تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر B. dorsalis باستخدام نظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. سيكون هذا البروتوكول بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام CRISPR / Cas9 هو أداة تحرير الجينات الأكثر استخداما وله تطبيقات مختلفة ، مثل الجينات threpy30 ، وتربية المحاصيل 31 ، والدراسات الأساسية لوظائف الجينات32. تم تطبيق هذا النظام بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات وكان بمثابة أداة فعالة للدراسات ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Shenzhen للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272) والصناديق الخاصة للابتكار في مجال تكنولوجيا العلوم والتنمية الصناعية لمنطقة Shenzhen Dapeng الجديدة (رقم المنحة. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Referencias
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genética. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
