Larvas de zebrafish como modelo para avaliar potenciais radiossensibilizadores ou protetores

Summary

O peixe-zebra tem sido recentemente explorado como um modelo para validar potenciais modificadores de radiação. O presente protocolo descreve as etapas detalhadas para o uso de embriões de zebrafish para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o efeito de diferentes tratamentos e radiação.

Abstract

Os peixes-zebra são amplamente utilizados em vários tipos de pesquisa porque são um dos modelos de vertebrados de fácil manutenção e exibem várias características de um sistema modelo único e conveniente. Como as células altamente proliferativas são mais suscetíveis a danos no DNA induzidos por radiação, os embriões de peixe-zebra são um modelo in vivo de linha de frente na pesquisa de radiação. Além disso, esse modelo projeta o efeito da radiação e de diferentes fármacos em um curto espaço de tempo, juntamente com os principais eventos biológicos e respostas associadas. Vários estudos sobre câncer têm utilizado peixe-zebra, e este protocolo é baseado no uso de modificadores de radiação no contexto da radioterapia e do câncer. Este método pode ser facilmente utilizado para validar os efeitos de diferentes fármacos em embriões irradiados e controles (não irradiados), identificando fármacos como radiossensibilizadores ou protetores. Embora essa metodologia seja usada na maioria dos experimentos de triagem de drogas, os detalhes do experimento e a avaliação da toxicidade com o histórico de exposição à radiação de raios X são limitados ou abordados apenas brevemente, dificultando sua execução. Este protocolo aborda essa questão e discute o procedimento e a avaliação da toxicidade com uma ilustração detalhada. O procedimento descreve uma abordagem simples para o uso de embriões de peixe-zebra para estudos de radiação e triagem de drogas baseadas em radiação com muita confiabilidade e reprodutibilidade.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal bem conhecido que tem sido amplamente utilizado em pesquisas nas últimas 3 décadas. É um pequeno peixe de água doce que é fácil de criar e reproduzir em condições de laboratório. O zebrafish tem sido extensivamente utilizado para diversos estudos de desenvolvimento e toxicológicos 1,2,3,4,5,6,7,8. O zebrafish tem alta fecundidade e curta geração embrionária; Os embriões são adequados para rastrear diferentes estágios de desenvolvimento, são visualmente transparentes e são passíveis de variedades de manipulação genética e plataformas de triagem de alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Além disso, o zebrafish fornece imagens in toto e ao vivo para as quais seu processo de desenvolvimento e diferentes deformidades na presença de várias substâncias ou fatores tóxicos podem ser facilmente estudados usando microscopia estéreo ou fluorescente 7,15,16.

A radioterapia é uma das principais modalidades terapêuticas utilizadas no tratamento do câncer 17,18,19,20,21,22,23,24. No entanto, a radioterapia do câncer exige potenciais radioprotetores para proteger as células normais saudáveis da morte enquanto matam células malignas ou salvaguardar a saúde humana durante a terapia envolvendo radiações de alta energia 25,26,27,28,29. Por outro lado, radiossensibilizadores potentes também estão sendo investigados para aumentar a eficiência da radiação em matar células malignas, especialmente em terapias direcionadas e de precisão30,31,32,33. Portanto, para validar radioprotetores e sensibilizadores potentes, um modelo adequado para triagem de drogas de nível semi-alto e exibindo efeitos de radiação de forma mensurável é altamente solicitado. Vários modelos disponíveis são usados em estudos de radiação e envolvidos em experimentos de triagem de drogas. No entanto, vertebrados superiores e até mesmo o modelo in vivo mais comumente usado, camundongos, são inadequados para triagem de drogas em larga escala porque é demorado, caro e desafiador projetar tais experimentos de triagem com esses modelos. Da mesma forma, modelos de cultura celular são ideais para variedades de experimentos de triagem de drogas de alto rendimento^34,35. No entanto, experimentos envolvendo cultura celular nem sempre são pragmáticos, altamente reprodutíveis ou confiáveis, pois as células em cultura podem mudar marcadamente seu comportamento de acordo com as condições de crescimento e cinética. Além disso, variedades de tipos celulares apresentam sensibilização diferencial à radiação. Notadamente, os sistemas de cultura de células 2D e 3D não representam todo o cenário do organismo e, portanto, os resultados obtidos podem não recapitular o real nível de radiotoxicidade^36,37. Nesse sentido, o zebrafish oferece diversas vantagens na triagem de novos radiossensibilizadores e radioprotetores. A facilidade de manuseio, o grande tamanho da ninhada, a curta vida útil, o rápido desenvolvimento embrionário, a transparência do embrião e o pequeno tamanho do corpo tornam o peixe-zebra um modelo adequado para triagem de drogas em larga escala. Devido às vantagens acima, os experimentos podem ser prontamente repetidos em um curto espaço de tempo, e o efeito pode ser observado facilmente sob um microscópio dissecante em placas de poços múltiplos. Assim, o peixe-zebra vem ganhando popularidade em pesquisas de triagem de drogas envolvendo estudos de radiação^38,39.

O potencial do zebrafish como modelo de triagem de modificadores de radiação tem sido demonstrado em vários estudos 40,41,42,43,44,45. O efeito radioprotetor de potenciais modificadores de rádio, como a nanopartícula DF1, amifostina (WR-2721), proteínas de reparo de DNA KU80 e ATM, e células-tronco hematopoéticas transplantadas, e os efeitos de radiossensibilizadores, como flavopiridol e AG1478, no modelo de zebrafish^têm sido relatados 19,41,42,43,44,45,46 . Usando o mesmo sistema, o efeito radioprotetor da DF-1 (nanopartícula de fulereno) foi avaliado em nível sistêmico e órgão-específico, e também o uso de embriões de peixe-zebra para triagem de radioprotetores foi mais explorado⁴⁷. Recentemente, o mel de Kelulut foi relatado como um radioprotetor em embriões de peixe-zebra e foi encontrado para aumentar a sobrevivência embrionária e prevenir danos órgão-específicos, danos ao DNA celular e apoptose⁴⁸.

Da mesma forma, os efeitos radioprotetores dos polímeros gerados pela reação de Hantzsch foram verificados em embriões de peixe-zebra em uma triagem de alto rendimento, e a proteção foi conferida principalmente pela proteção das células contra danos ao DNA⁴⁹. Em um dos estudos anteriores, a estatina lipofílica fluvastatina foi encontrada como um potencial radiossensibilizador usando o modelo zebrafish com esta abordagem⁵⁰. Da mesma forma, as nanopartículas de ouro são consideradas um radiossensibilizador ideal e têm sido utilizadas em muitos^estudos51,52.

O desenvolvimento embrionário em peixe-zebra envolve clivagem nas 3 h iniciais em que um zigoto unicelular se divide para formar 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, 32 células e 64 células que são facilmente identificadas com um estereomicroscópio. Em seguida, atinge o estágio de blástula com 128 células (2,25 h pós-fecundação, hpf), onde as células dobram a cada 15 min e passam pelas seguintes etapas: 256 células (2,5 hpf), 512 células (2,75 hpf), e atingindo 1.000+ células em apenas 3 h (Figura 1). Às 4 h, o ovo atinge o estágio esférico, seguido da formação de uma forma de cúpula na massa embrionária 7,53,54. A gastrulação em peixe-zebra começa a partir de 5,25 hpf⁵⁴, onde atinge o estágio de escudo. O escudo indica claramente o rápido movimento de convergência das células para um lado do anel germinativo (Figura 1) e é uma fase proeminente e distinta de embriões gastrulantes que pode ser facilmente identificada^53,54. Embora a exposição à radiação em embriões possa ser feita em qualquer estágio de seu desenvolvimento, a exposição à radiação durante a gastrulação pode ter alterações morfológicas mais distintas, facilitando uma melhor leitura das toxicidades induzidas pela radiação⁵⁵; Da mesma forma, a administração de fármacos em embriões pode ser iniciada já a partir de 2^HPF54.

Protocol

O presente estudo foi conduzido com aprovação prévia e seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto de Ciências da Vida de Bhubaneswar. Todas as manutenções e reproduções de zebrafish foram conduzidas em uma instalação de piscicultura ambiente a 28,5 °C, e os embriões foram mantidos em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO) a uma temperatura de 28,5 °C. Neste caso, foi utilizada a linhagem AB do zebrafish, e o estadiamento foi realizado de acordo com Kimmel …

Representative Results

O layout geral do protocolo está representado na Figura 2. O efeito da radiação e a caracterização de forma dose-dependente foram avaliados com as seguintes análises. Avaliação da toxicidade induzida por raios XCom o uso de estereomicroscópio, as seguintes anormalidades foram avaliadas e caracterizadas após o tratamento medicamentoso e/ou radiação. De acordo com as diretrizes da OCDE 61, para avaliação da toxicid…

Discussion

Zebrafish são usados como modelos valiosos em muitos estudos, incluindo vários tipos de pesquisa de câncer. Esse modelo fornece uma plataforma útil para a triagem de drogas em larga escala^67,68. Como qualquer outro método de avaliação de toxicidade, a avaliação quantitativa das principais alterações biológicas decorrentes da radiação e/ou tratamento medicamentoso é a parte mais crucial deste protocolo. Nesses tipos de estudos, a sobrevida não deve…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL