Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única
Summary
Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.
Abstract
A capacidade das células de responder a sinais externos é essencial para o desenvolvimento, crescimento e sobrevivência celular. Para responder a um sinal do ambiente, uma célula deve ser capaz de reconhecê-lo e processá-lo. Esta tarefa baseia-se principalmente na função dos receptores de membrana, cujo papel é converter sinais na linguagem bioquímica da célula. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de proteínas receptoras de membrana em humanos. Entre os GPCRs, os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são uma subclasse única que funcionam como dímeros obrigatórios e possuem um grande domínio extracelular que contém o sítio de ligação do ligante. Avanços recentes em estudos estruturais de mGluRs melhoraram a compreensão de seu processo de ativação. No entanto, a propagação de alterações conformacionais em larga escala através de mGluRs durante a ativação e modulação é pouco compreendida. A transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica poderosa para visualizar e quantificar a dinâmica estrutural de biomoléculas no nível de proteína única. Para visualizar o processo dinâmico de ativação do mGluR2, foram desenvolvidos sensores conformacionais fluorescentes baseados na incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) que permitiram a marcação de proteínas site-specific sem perturbação da estrutura nativa dos receptores. O protocolo descrito aqui explica como realizar esses experimentos, incluindo a nova abordagem de rotulagem de UAA, preparação de amostras e aquisição e análise de dados smFET. Essas estratégias são generalizáveis e podem ser estendidas para investigar a dinâmica conformacional de uma variedade de proteínas de membrana.
Introduction
A transferência de informações através da membrana plasmática é fortemente dependente da função dos receptores de membrana1. A ligação do ligante a um receptor leva a uma alteração conformacional e à ativação do receptor. Este processo é muitas vezes alostérico na natureza2. Com mais de 800 membros, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de membrana em humanos3. Devido ao seu papel em quase todos os processos celulares, os GPCRs tornaram-se alvos importantes para o desenvolvimento terapêutico. No modelo canônico de sinalização GPCR, a ativação do agonista resulta em alterações conformacionais do receptor que subsequentemente ativam o complexo proteico G heterotrimérico via troca de PIB por GTP na bolsa de ligação de nucleotídeos de Gα. As subunidades G α-GTP e Gβγ ativadas controlam a atividade das proteínas efetoras a jusante e propagam a cascata de sinalização 4,5. Este processo de sinalização depende essencialmente da capacidade dos ligantes de alterar a forma tridimensional do receptor. Uma compreensão mecanicista de como os ligantes conseguem isso é fundamental para o desenvolvimento de novas terapêuticas e o design de receptores e sensores sintéticos.
Os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são membros da família GPCR classe C e são importantes para os efeitos neuromoduladores lentos do glutamato e para a excitabilidade neuronal de sintonia 6,7. Entre todos os GPCRs, os GPCRs de classe C são estruturalmente únicos, pois funcionam como dímeros obrigatórios. Os mGluRs contêm três domínios estruturais: o domínio da armadilha de Vênus (VFT), o domínio rico em cisteína (CRD) e o domínio transmembrana (TMD)8. As mudanças conformacionais durante o processo de ativação são complexas e envolvem acoplamento conformacional local e global que se propagam a uma distância de 12 nm, bem como a cooperatividade do dímero. As conformações intermediárias, a ordenação temporal dos estados e a taxa de transição entre os estados são desconhecidas. Seguindo a conformação de receptores individuais em tempo real, é possível identificar os estados intermediários transitórios e a sequência de alterações conformacionais durante a ativação. Isso pode ser conseguido por meio da aplicação de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única 9,10 (smFRET), como foi recentemente aplicado para visualizar a propagação de alterações conformacionais durante a ativação do mGluR2 11. Um passo fundamental nos experimentos FRET é a geração de sensores FRET pela inserção site-specific dos fluoróforos doador e aceitador na proteína de interesse. Uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adotada 12,13,14,15 para superar as limitações das tecnologias típicas de marcação fluorescente site-specific que exigem a criação de mutantes sem cisteína ou a inserção de uma grande etiqueta geneticamente codificada. Isso permitiu observar o rearranjo conformacional do essencial ligador alostérico compacto, que uniu os domínios de ligação e sinalização do ligante do mGluR2. Neste protocolo, um guia passo-a-passo para a realização de experimentos smFRET em mGluR2 é apresentado, incluindo a abordagem para marcação site-specific de mGluR2 com UAA para anexar fluoróforos usando a reação de ciclização azida catalisada por cobre. Além disso, este protocolo descreve a metodologia para a captura direta de proteínas de membrana e análise de dados. O protocolo descrito aqui também é aplicável ao estudo da dinâmica conformacional de outras proteínas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCRs são proteínas que operam na membrana celular para iniciar a transdução de sinal. Muitos GPCRs consistem em vários domínios, com a sinalização sendo dependente da interação cooperativa entre os domínios. Para modular as propriedades desses receptores de membrana, é essencial entender o comportamento dinâmico dos múltiplos domínios. A transferência de energia por ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica de fluorescência que permite a medição da conformação e din…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório Reza Vafabakhsh pelas discussões. Este trabalho foi apoiado pelo subsídio R01GM140272 dos Institutos Nacionais de Saúde (para R.V.), pelo Searle Leadership Fund for the Life Sciences da Northwestern University e pelo Chicago Biomedical Consortium com o apoio dos Searle Funds no The Chicago Community Trust (para R.V.). B.W.L. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
Referencias
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
