Yeni ilaç dağıtım sistemlerinin daha rasyonel değerlendirilmesini sağlamak için akış sitometrisi kullanılarak ilaç taşıyıcı-hücre etkileşimlerinin mutlak ölçümü için bir iş akışı gösterilmiştir. Bu iş akışı, her türlü ilaç taşıyıcısı için geçerlidir.
İlaç dağıtım sistemlerinin tasarlanmasının önemli bir bileşeni, belirli hücre tipleriyle etkileşimlerin nasıl artırılacağı veya azaltılacağı ile ilgilidir. Örneğin, bir kemoterapi, kanser hücrelerine bağlanmayı arttırmak için bir antikor ile işlevselleştirilebilir (“hedefleme”) veya bağışıklık hücresi tanımadan kaçınmaya yardımcı olmak için polietilen glikol ile işlevselleştirilebilir (“gizlilik”). Hücresel düzeyde bile, bir ilaç taşıyıcısının bağlanmasını ve alımını optimize etmek karmaşık bir biyolojik tasarım problemidir. Bu nedenle, yeni bir taşıyıcının bir hücreyle ne kadar güçlü etkileşime girdiğini, bir taşıyıcının kargosunun o hücreye teslim edildikten sonraki işlevsel etkinliğinden ayırmak değerlidir.
Kemoterapötik örneğe devam etmek gerekirse, “bir kanser hücresine ne kadar iyi bağlandığı”, “bir kanser hücresini ne kadar iyi öldürür” den ayrı bir sorundur. İkincisi için kantitatif in vitro testler iyi kurulmuştur ve genellikle canlılığın ölçülmesine dayanır. Bununla birlikte, hücre-taşıyıcı etkileşimleri üzerine yayınlanan araştırmaların çoğu kalitatif veya yarı kantitatiftir. Genel olarak, bu ölçümler taşıyıcının floresan etiketlemesine dayanır ve sonuç olarak, göreceli veya keyfi birimlerdeki hücrelerle etkileşimleri bildirir. Bununla birlikte, bu çalışma standartlaştırılabilir ve az sayıda karakterizasyon deneyi ile kesinlikle nicel hale getirilebilir. Bu tür mutlak niceleme, çeşitli ilaç dağıtım sistemlerinin (nanopartiküller, mikropartiküller, virüsler, antikor-ilaç konjugatları, mühendislik terapötik hücreleri veya hücre dışı veziküller) rasyonel, sınıflar arası ve sınıflar arası karşılaştırmalarını kolaylaştırdığı için değerlidir.
Ayrıca, niceleme, sonraki meta-analizler veya in silico modelleme yaklaşımları için bir ön koşuldur. Bu makalede, taşıyıcı ilaç dağıtım sistemleri için in vitro nicelemenin nasıl sağlanacağına dair bir karar ağacının yanı sıra, taşıyıcı boyut ve etiketleme yöntemindeki farklılıkları dikkate alan video kılavuzları sunulmaktadır. Ek olarak, gelişmiş ilaç dağıtım sistemlerinin nicel değerlendirmesi için daha fazla husus tartışılmaktadır. Bunun, yeni nesil tıp için rasyonel değerlendirme ve tasarımı geliştirmek için değerli bir kaynak olarak hizmet etmesi amaçlanmıştır.
Hangi hücre tipiyle karşılaştıklarına bağlı olarak spesifik, tasarlanmış davranış sergileyen ilaç dağıtım yapılarının tasarımı, önemli araştırma ilgisini çekmiştir. Potansiyel ilaç dağıtım yapıları veya “taşıyıcılar” arasında lipit formülasyonları, nano-yetiştirilen inorganikler, polimerik montajlar, hücre dışı veziküller, işlevselleştirilmiş bakteri hücreleri veya modifiye virüsler bulunur. Bunların hepsi, fiziksel özellikler, yüzey özellikleri veya antikor eki1,2 gibi mühendislik kimyasal işlevlerine bağlı olarak organ, doku veya hücre özgüllüğü gösterebilir.
İn vitro taşıyıcı değerlendirmesinde neredeyse her yerde bulunan bir adım, söz konusu ilaç yüklü taşıyıcıyı içeren bir süspansiyonla hücreleri inkübe etmektir. Kuluçka sonrası, taşıyıcı performansı, ilaç kargosunun performansının, örneğin transfeksiyon verimliliği veya toksisitesinin işlevsel bir okuması ile ölçülür. İşlevsel okumalar, taşıyıcı etkinliğinin aşağı akış ölçüsü oldukları için yararlıdır. Bununla birlikte, daha karmaşık ilaç dağıtım yapıları için, fonksiyonel okumaların ötesine geçmek ve ilgilenilen hücre ile taşıyıcı etkileşiminin derecesini ayrı ayrı ölçmek giderek daha önemlidir. Bunun birkaç nedeni var.
İlk olarak, çeşitli yükleri taşıyabilen “platform” taşıyıcı teknolojilerini keşfetmeye (ve yinelemeli olarak iyileştirmeye) artan ilgi var. Örneğin, RNA’yı kapsüllemek için tasarlanmış lipit nanopartikülleri (LNP’ler), birkaç uyarı3 ile bir RNA dizisini diğeriyle değiştirebilir. Bu nedenle, taşıyıcı teknolojisini yinelemeli olarak geliştirmek için, kargo işlevselliğinden bağımsız olarak performansını ölçmek çok önemlidir. İkincisi, fonksiyonel okumalar, taşıyıcı formülasyonlarını hızlı bir şekilde yineleme ve değerlendirme yeteneğinden ödün vererek, ilgilenilen kargo için basit olmayabilir. Basit bir fonksiyonel okuma (örneğin, floresan) ile bir model kargo kullanarak in vitro optimizasyon yapılabilirken, kargonun değiştirilmesi bir taşıyıcı4’e biyolojik tepkiyi değiştirebilir ve bu nedenle temsili sonuçlar vermeyebilir. Üçüncüsü, birçok taşıyıcı belirli bir hücre tipi ile etkileşime girmek ve bunlar tarafından ele geçirilmek üzere tasarlanmıştır. Bir taşıyıcının bu hedefleme yeteneği , terapötik kargo sonrası hedeflemesinin performansından ayırt edilebilir ve edilmelidir. LNP örneğine devam etmek için, bir RNA kargosu son derece güçlü olabilir, ancak LNP hücreye bağlanamazsa, içselleştirilemez ve RNA’yı serbest bırakamazsa, aşağı akış fonksiyonel etkisi gözlenmez. Bu, özellikle T hücreleri5 gibi transfekte edilmesi zor hücre tiplerini hedeflemeyi amaçlayan taşıyıcılar için bir sorun olabilir. Tersine, bir LNP son derece etkili bir şekilde hedefleyebilir, ancak RNA kargosu çalışmayabilir. Sadece kargo işlevselliğini ölçen bir aşağı akış testi, bu iki durum arasında ayrım yapamaz, böylece taşıyıcı ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesini ve optimizasyonunu zorlaştırır.
Bu çalışmada, taşıyıcı ilişkisinin kesin olarak nasıl ölçüleceği tartışılmıştır. İlişkilendirme, bir taşıyıcı ile bir hücre arasındaki deneysel olarak ölçülen etkileşim derecesini ifade eden bir terimdir. İlişkilendirme, membran bağlama ve içselleştirme arasında ayrım yapmaz – bir taşıyıcı, hücre yüzeyine bağlı olduğu veya hücre onu içselleştirdiği için ilişkili olabilir. İlişkilendirme genellikle hücre taşıyıcı inkübasyon deneylerinin bir parçası olarak ölçülür. Tarihsel olarak, ilişkilendirme ya keyfi floresan birimlerinde (tipik olarak “medyan floresan yoğunluğu” veya MFI) ya da sınırlamaları daha önce tartışılan metrikler olan “yüzde ilişkisi” olarak bildirilmiştir6. Kısacası, bu ölçümler deneysel protokoller, akış sitometresi ayarları ve farklı taşıyıcıların etiketleme yoğunluklarındaki farklılıklar nedeniyle deneyler, laboratuvarlar ve ilaç taşıyıcıları arasında karşılaştırılamaz. Sitometreyi kalibre ederek birincisinin üstesinden gelmek için çaba sarf edilmiştir, böylece MFI’nin göreceli ölçüsünü kesinlikle nicel bir floresan7 ölçüsüne dönüştürmüştür. Bununla birlikte, bu yöntem çeşitli taşıyıcıların etiketleme yoğunluğundaki değişkenliği hesaba katmaz ve bu nedenle,8. seçimin hedef hücresindeki çeşitli taşıyıcı performanslarının rasyonel olarak karşılaştırılmasına izin vermez.
Burada, göreceli, keyfi floresan birimlerinden “hücre başına taşıyıcı sayısının” mutlak nicel metriğine pratik olarak nasıl dönüştürüleceği, az sayıda ek karakterizasyon deneyi yapılarak gösterilmiştir. Başka bir taşıyıcı konsantrasyonu metriği istenirse (örneğin, hücre başına taşıyıcı kütle veya hücre başına taşıyıcı hacim), taşıyıcı karakterizasyonu yapılmış olması koşuluyla, hücre başına taşıyıcılardan dönüştürmek kolaydır. Kısalık ve jargondan kaçınmak için, “taşıyıcı” kelimesi bu çalışmada ilaç dağıtım yapılarının geniş çeşitliliğine atıfta bulunmak için kullanılmıştır. Bu niceleme teknikleri, nano mühendislik ürünü bir altın parçacığına veya biyo-mühendislik ürünü bir bakteriye uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın eşit derecede uygulanabilir.
Birkaç gerçek, keyfi floresan birimlerinden hücre başına taşıyıcılara dönüşümü mümkün kılar. İlk olarak, ölçülen floresan yoğunluğu, floresanın cihazın algılama sınırları içinde olduğu ve enstrümantasyon ayarlarının aynı olduğu varsayılarak, bir florofor9’un (veya floresan olarak etiketlenmiş bir taşıyıcının) konsantrasyonu ile orantılıdır. Böylece, bir taşıyıcının floresansı ve bir numunenin floresansı biliniyorsa, tüm ölçümler aynı ayarlar ve koşullar altında gerçekleştirilmişse, o numunede kaç taşıyıcının bulunduğu belirlenebilir. Bununla birlikte, özellikle küçük taşıyıcılar için, aynı cihazda aynı aletlerde taşıyıcı floresansı, hücre otofloresansını ve taşıyıcılarla ilişkili hücre floresansını aynı ayarlarla ölçmek mümkün olmayabilir. Bu durumda, bir cihazda ölçülen floresan ile başka bir cihazda ölçülen floresan arasında dönüştürme yapmayı mümkün kılmak için ikinci bir gereklilik vardır. Bunu yapmak için, Eşdeğer Çözünür Florokrom Molekülleri (MESF) standart9’dan yararlanarak, her iki cihazdaki floresan yoğunluğunu ölçmek için standart bir florofor konsantrasyonu eğrisi oluşturulabilir. Bu daha sonra, taşıyıcı floresansının sitometre olmayan bir sitometre üzerinde toplu olarak ölçülmesine izin verir, bu da herhangi bir boyut veya özellikteki taşıyıcılar üzerinde yapılabilecek bir ölçümdür. Bu tür bir kütle miktarı, bilinen konsantrasyondaki bir taşıyıcı süspansiyonunda yapıldığında, bir numunenin hücresi başına düşen taşıyıcı sayısı, bir kez daha, hesaplanabilir.
Bu çalışma, taşıyıcı ilişkisini ölçme sürecini gösterirken (ölçülen floresan yoğunluğu ile belirlendiği gibi), hücre-taşıyıcı etkileşiminin diğer ölçümleri için benzer bir protokol gerçekleştirilebilir (örneğin, içselleştirilmiş ve membrana bağlı taşıyıcıları ayırt eden deneysel bir protokol). Ek olarak, eğer ilişki floresan olmayan bir tahlille (örneğin, kütle sitometrisi yoluyla) ölçülürse, bu protokol büyük ölçüde aynı olacaktır.
İlaç taşıyıcıları ve hücreler arasındaki etkileşimlerin karakterize edilmesi, yeni ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Spesifik olarak, çeşitli taşıyıcı yapıların rasyonel olarak değerlendirilmesine ve karşılaştırılmasına izin vermek için, söz konusu taşıyıcının hedef ve hedef dışı hücrelerle etkileşime girme performansının mutlak olarak ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Bu protokol, bir ilaç taşıyıcısı ile çalışan her…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC; Program Hibe No. GNT1149990), Avustralya HIV ve Hepatit Viroloji Araştırma Merkezi (ACH2) ve Réjane Louise Langlois’in mülkünden bir hediye. FC, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Kıdemli Baş Araştırma Bursu (GNT1135806) ödülünü kabul eder. Şekil 1 ve Şekil 2 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |