Experimentele kwantificering van interacties tussen medicijnafgiftesystemen en cellen in vitro: een gids voor preklinische nanogeneeskunde-evaluatie

Summary

Een workflow wordt gedemonstreerd voor de absolute kwantificering van geneesmiddeldrager-celinteracties met behulp van flowcytometrie om een betere rationele evaluatie van nieuwe medicijnafgiftesystemen mogelijk te maken. Deze workflow is van toepassing op drugsdragers van elk type.

Abstract

Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van medicijnafgiftesystemen betreft het versterken of verzwakken van interacties met specifieke celtypen. Een chemotherapeuticum kan bijvoorbeeld worden gefunctionaliseerd met een antilichaam om de binding aan kankercellen te verbeteren (“targeting”) of gefunctionaliseerd met polyethyleenglycol om immuuncelherkenning te helpen ontwijken (“stealth”). Zelfs op cellulair niveau is het optimaliseren van de binding en opname van een medicijndrager een complex biologisch ontwerpprobleem. Het is dus waardevol om te scheiden hoe sterk een nieuwe drager interageert met een cel en de functionele effectiviteit van de lading van een vervoerder zodra deze in die cel is afgeleverd.

Om het chemotherapeutische voorbeeld voort te zetten, “hoe goed het bindt aan een kankercel” is een ander probleem dan “hoe goed het een kankercel doodt”. Kwantitatieve in vitro assays voor de laatste zijn goed ingeburgerd en zijn meestal afhankelijk van het meten van de levensvatbaarheid. Het meeste gepubliceerde onderzoek naar cel-dragerinteracties is echter kwalitatief of semikwantitatief. Over het algemeen zijn deze metingen afhankelijk van fluorescerende etikettering van de drager en rapporteren bijgevolg interacties met cellen in relatieve of willekeurige eenheden. Dit werk kan echter worden gestandaardiseerd en absoluut kwantitatief worden gemaakt met een klein aantal karakteriseringsexperimenten. Een dergelijke absolute kwantificering is waardevol, omdat het rationele, inter- en intra-class vergelijkingen van verschillende medicijnafgiftesystemen – nanodeeltjes, microdeeltjes, virussen, antilichaam-geneesmiddelconjugaten, gemanipuleerde therapeutische cellen of extracellulaire blaasjes – vergemakkelijkt.

Bovendien is kwantificering een voorwaarde voor latere meta-analyses of de silico-modelleringsbenaderingen. In dit artikel worden videogidsen gepresenteerd, evenals een beslisboom voor het bereiken van in vitro kwantificering voor carrier drug delivery-systemen, die rekening houden met verschillen in dragergrootte en etiketteringsmodaliteit. Daarnaast worden verdere overwegingen voor de kwantitatieve beoordeling van geavanceerde toedieningssystemen voor geneesmiddelen besproken. Dit is bedoeld als een waardevolle bron om rationele evaluatie en ontwerp voor de volgende generatie geneeskunde te verbeteren.

Introduction

Het ontwerp van medicijnafgifteconstructies die specifiek, ontworpen gedrag vertonen, afhankelijk van welk celtype ze tegenkomen, heeft aanzienlijke onderzoeksinteresse getrokken. Potentiële medicijnafgifteconstructies of “dragers” omvatten lipideformuleringen, nanogekweekte anorganische, polymere assemblages, extracellulaire blaasjes, gefunctionaliseerde bacteriële cellen of gemodificeerde virussen. Al deze kunnen orgaan-, weefsel- of celspecificiteit vertonen als gevolg van fysische eigenschappen, oppervlakte-eigenschappen of gemanipuleerde chemische functionalisaties zoals antilichaamaanhechting ^1,2.

Een bijna alomtegenwoordige stap in in vitro dragerschapsevaluatie is het incuberen van cellen met een suspensie die de met geneesmiddelen geladen drager bevat. Na incubatie worden de prestaties van de drager gemeten via een functionele uitlezing van de prestaties van de medicijnlading, bijvoorbeeld transfectie-efficiëntie of toxiciteit. Functionele uitlezingen zijn nuttig, omdat ze een downstream-maat zijn voor de effectiviteit van de drager. Voor complexere medicijnafgifteconstructies wordt het echter steeds belangrijker om verder te gaan dan functionele uitlezingen en afzonderlijk de mate van dragerinteractie met de cel van belang te kwantificeren. Daar zijn een paar redenen voor.

Ten eerste is er een toenemende interesse in het ontdekken (en iteratief verbeteren) van “platform” carrier-technologieën, die een verscheidenheid aan lading kunnen vervoeren. Lipide nanodeeltjes (LNP’s) die zijn ontworpen om RNA in te kapselen, kunnen bijvoorbeeld de ene RNA-sequentie inruilen voor de andere met enkele kanttekeningen³. Om de carriertechnologie iteratief te verbeteren, is het dus van cruciaal belang om de prestaties ervan onafhankelijk van de vrachtfunctionaliteit te kwantificeren. Ten tweede zijn functionele uitlezingen mogelijk niet eenvoudig voor de lading van belang, waardoor het vermogen om vervoerdersformuleringen snel te herhalen en te evalueren in gevaar komt. Hoewel men in vitro optimalisatie zou kunnen uitvoeren met behulp van een modellading met een eenvoudige functionele uitlezing (bijvoorbeeld fluorescentie), kan het veranderen van de lading de biologische reactie op een drager⁴ veranderen en dus geen representatieve resultaten opleveren. Ten derde zijn veel dragers ontworpen om te interageren met en te worden opgenomen door een specifiek celtype. Een dergelijke targetingcapaciteit van een vervoerder kan en moet worden onderscheiden van de prestaties van zijn therapeutische vrachtposttargeting. Om het LNP-voorbeeld voort te zetten, kan een RNA-lading extreem krachtig zijn, maar als de LNP niet in staat is om aan de cel te binden, geïnternaliseerd te worden en het RNA vrij te geven, zal er geen downstream functioneel effect worden waargenomen. Dit kan met name een probleem zijn voor dragers die bedoeld zijn om zich te richten op moeilijk te transfecteren celtypen, zoals T-cellen⁵. Omgekeerd kan een LNP extreem effectief targeten, maar de RNA-lading functioneert mogelijk niet. Een downstream-test die alleen de vrachtfunctionaliteit meet, zal geen onderscheid kunnen maken tussen deze twee situaties, waardoor de ontwikkeling en optimalisatie van carrier-medicijnafgiftesystemen wordt bemoeilijkt.

In dit werk wordt besproken hoe de associatie van dragers absoluut kan worden gekwantificeerd. Associatie is een term die verwijst naar de experimenteel gemeten mate van interactie tussen een drager en een cel. Associatie maakt geen onderscheid tussen membraanbinding en internalisatie – een drager kan worden geassocieerd omdat deze gebonden is aan het celoppervlak of omdat de cel het heeft geïnternaliseerd. Associatie wordt vaak gemeten als onderdeel van celdrager-incubatie-experimenten. Historisch gezien is associatie gemeld in willekeurige fluorescerende eenheden (meestal “mediane fluorescentie-intensiteit” of MFI) of als “procentassociatie”, statistieken waarvan de beperkingen eerder zijn besproken⁶. Kortom, deze metingen zijn niet vergelijkbaar tussen experimenten, laboratoria en medicijndragers vanwege verschillen in experimentele protocollen, flowcytometerinstellingen en de etiketteringsintensiteiten van verschillende dragers. Er zijn pogingen gedaan om de eerste te overwinnen door de cytometer te kalibreren, waardoor de relatieve maat van MFI wordt omgezet in een absoluut kwantitatieve maat voor fluorescentie⁷. Deze methode houdt echter geen rekening met de variabiliteit in de etiketteringsintensiteit van verschillende dragers en maakt dus geen rationele vergelijking van verschillende dragerprestaties in een doelcel van keuze^{mogelijk 8}.

Hier wordt het praktisch converteren van relatieve, willekeurige fluorescerende eenheden naar de absolute kwantitatieve metriek van het “aantal dragers per cel” aangetoond door een klein aantal aanvullende karakteriseringsexperimenten uit te voeren. Als een andere metriek van dragerconcentratie gewenst is (bijvoorbeeld dragermassa per cel of dragervolume per cel), is het eenvoudig om te converteren van dragers per cel, op voorwaarde dat carrierkarakterisering is uitgevoerd. Kortheidshalve en om jargon te vermijden, wordt het woord “drager” in dit werk gebruikt om te verwijzen naar het enorme assortiment van medicijnafgifteconstructies. Deze kwantificeringstechnieken zijn even toepasbaar, of ze nu worden toegepast op een nano-gemanipuleerd gouddeeltje of een bio-engineered bacteriën.

Enkele feiten maken de omzetting van willekeurige fluorescerende eenheden naar dragers per cel mogelijk. Ten eerste is de gemeten fluorescentie-intensiteit evenredig met de concentratie van een fluorofoor⁹ (of een fluorescerend gelabelde drager), ervan uitgaande dat de fluorescentie binnen de detectiegrenzen van het instrument valt en de instrumentatie-instellingen hetzelfde zijn. Als de fluorescentie van een drager en de fluorescentie van een monster bekend zijn, kan men dus bepalen hoeveel dragers er in dat monster aanwezig zijn als alle metingen onder dezelfde instellingen en omstandigheden zijn uitgevoerd. Vooral voor kleinere dragers is het echter mogelijk niet mogelijk om dragerfluorescentie, celautofluorescentie en cel-geassocieerde fluorescentie te meten op hetzelfde instrument met dezelfde instellingen. In dit geval is er een tweede vereiste om het mogelijk te maken om te converteren tussen gemeten fluorescentie op het ene instrument en gemeten fluorescentie op een ander instrument. Om dit te doen, kan een standaardcurve van fluorofoorconcentratie worden vastgesteld om de fluorescentie-intensiteit op beide instrumenten te meten, gebruikmakend van de moleculen van equivalent oplosbaar fluorochroom (MESF) standaard⁹. Dit maakt het vervolgens mogelijk om de dragerfluorescentie in bulk te meten op een niet-cytometer, een meting die kan worden uitgevoerd op dragers van elke grootte of eigenschap. Wanneer een dergelijke bulkkwantificering wordt uitgevoerd op een dragersuspensie van bekende concentratie, kan het aantal dragers per cel van een monster opnieuw worden berekend.

Hoewel dit werk het proces demonstreert voor het meten van dragerassociatie (zoals bepaald door gemeten fluorescentie-intensiteit), kan een analoog protocol worden uitgevoerd voor andere metingen van cel-dragerinteractie (bijvoorbeeld een experimenteel protocol dat geïnternaliseerde en membraangebonden dragers differentieert). Bovendien zou dit protocol grotendeels hetzelfde zijn als de associatie werd gemeten door middel van een niet-fluorescerende test (bijvoorbeeld door massacytometrie).

Protocol

1. De juiste stream kiezen Volg de beslisboom in figuur 1 om de beste workflow (stream) (figuur 2) te bepalen voor de gebruikte experimentele opstelling. Raadpleeg de discussie voor meer commentaar op deze streamkeuze. Als u de cytometerstroom volgt, gaat u verder met stap 2.1.1-2.2.7. Als u de bulkstream volgt, gaat u verder met stappen 3.1.1.1-3.1.5.7. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-page…

Representative Results

Zoals eerder besproken, vereisen verschillende soorten medicijndragers het gebruik van verschillende technieken voor de absolute kwantificering van celdragerassociatie. Bijvoorbeeld, 633 nm disulfide-gestabiliseerde poly (methacrylzuur) (PMASH) kern-schil deeltjes zijn groot en dicht genoeg voor detectie met behulp van een gevoelige flowcytometer. Als zodanig werden deze deeltjes fluorescerend gelabeld, vervolgens omheind en geteld met behulp van zijhoeklichtverstrooiing (SALS, analoog aan SSC), evenals het ju…

Discussion

Het karakteriseren van de interacties tussen medicijndragers en cellen wordt steeds belangrijker bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnafgiftesystemen. Specifiek, om de rationele evaluatie en vergelijking van verschillende dragerconstructies mogelijk te maken, is absolute kwantificering van de prestaties van die drager om te interageren met doel- en off-target cellen van cruciaal belang. Dit protocol beschrijft een tweestromenmethodologie waarmee elke onderzoeker die met een medicijndrager werkt, relatieve, semikwantifi…

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard