약물 전달 시스템과 체 외 세포 간의 상호 작용에 대한 실험적 정량화: 전임상 나노의학 평가를 위한 가이드
Summary
유세포분석을 사용하여 약물 운반체-세포 상호 작용의 절대 정량화를 위한 워크플로우를 입증하여 새로운 약물 전달 시스템을 보다 합리적으로 평가할 수 있습니다. 이 워크 플로우는 모든 유형의 약물 운반자에게 적용 할 수 있습니다.
Abstract
약물 전달 시스템 설계의 주요 구성 요소는 특정 세포 유형과의 상호 작용을 증폭하거나 약화시키는 방법에 관한 것입니다. 예를 들어, 화학 요법은 암세포에 대한 결합을 향상시키는 항체로 기능화 ( “표적화”) 또는 면역 세포 인식을 회피하는 데 도움이되는 폴리에틸렌 글리콜로 기능화 될 수 있습니다 ( “스텔스”). 세포 수준에서도 약물 운반체의 결합 및 흡수를 최적화하는 것은 복잡한 생물학적 설계 문제입니다. 따라서 새로운 담체가 세포와 얼마나 강하게 상호 작용하는지와 일단 해당 세포로 전달되면 담체의화물의 기능적 효능을 분리하는 것이 중요합니다.
화학 요법의 예를 계속하기 위해 “암세포에 얼마나 잘 결합하는지”는 “암세포를 얼마나 잘 죽이는지”와는 별개의 문제입니다. 후자에 대한 정량적 체외 분석은 잘 확립되어 있으며 일반적으로 생존력 측정에 의존합니다. 그러나 세포-운반체 상호 작용에 대한 대부분의 발표 된 연구는 정 성적 또는 반 정량적입니다. 일반적으로 이러한 측정은 캐리어의 형광 표지에 의존하며 결과적으로 상대적 또는 임의의 단위로 세포와의 상호 작용을 보고합니다. 그러나이 작업은 표준화 될 수 있으며 소수의 특성화 실험으로 절대적으로 정량적으로 만들 수 있습니다. 이러한 절대 정량화는 나노입자, 마이크로입자, 바이러스, 항체-약물 접합체, 조작된 치료 세포 또는 세포외 소포와 같은 다양한 약물 전달 시스템의 합리적, 클래스 간 및 클래스 내 비교를 용이하게 하기 때문에 가치가 있습니다.
또한 정량화는 후속 메타 분석 또는 인실리코 모델링 접근 방식의 전제 조건입니다. 이 기사에서는 캐리어 크기 및 라벨링 양식의 차이를 고려한 캐리어 약물 전달 시스템에 대한 체외 정량화를 달성하는 방법에 대한 의사 결정 트리와 비디오 가이드를 제공합니다. 또한 고급 약물 전달 시스템의 정량적 평가에 대한 추가 고려 사항이 논의됩니다. 이것은 차세대 의학을위한 합리적인 평가와 설계를 향상시키는 귀중한 자원으로 사용하기위한 것입니다.
Introduction
만나는 세포 유형에 따라 특이적이고 설계된 행동을 나타내는 약물 전달 구조체의 설계는 상당한 연구 관심을 끌었습니다. 잠재적인 약물 전달 구축물 또는 “담체”는 지질 제형, 나노성장 무기물, 중합체 어셈블리, 세포외 소포, 기능화된 박테리아 세포, 또는 변형된 바이러스를 포함한다. 이들 모두는 물리적 특성, 표면 특성 또는 항체 부착 1,2와 같은 공학적 화학적 기능화로 인해 장기, 조직 또는 세포 특이성을 나타낼 수 있습니다.
시험관내 담체 평가에서 거의 유비쿼터스 단계는 상기 약물 로딩 담체를 함유하는 현탁액으로 세포를 배양하는 것이다. 인큐베이션 후, 담체 성능은 약물 화물의 성능, 예를 들어 형질주입 효율 또는 독성의 기능적 판독을 통해 측정된다. 기능 판독값은 캐리어 효율성의 다운스트림 척도이므로 유용합니다. 그러나 더 복잡한 약물 전달 구조체의 경우 기능적 판독을 넘어 관심 세포와의 캐리어 상호 작용 정도를 개별적으로 정량화하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에는 몇 가지 이유가 있습니다.
첫째, 다양한화물을 운반 할 수있는 “플랫폼”운송 기술을 발견 (및 반복적으로 개선)하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 예를 들어, RNA를 캡슐화하도록 설계된 지질 나노 입자 (LNP)는 몇 가지주의 사항없이 하나의 RNA 서열을 다른 RNA 서열로 교환 할 수 있습니다3. 따라서 캐리어 기술을 반복적으로 개선하려면 화물 기능과 관계없이 성능을 정량화하는 것이 중요합니다. 둘째, 기능적 판독은 관심 화물에 대해 간단하지 않을 수 있으며, 캐리어 제형을 신속하게 반복하고 평가하는 능력을 손상시킬 수 있습니다. 간단한 기능 판독(예: 형광)이 있는 모델 화물을 사용하여 시험관 내 최적화를 수행할 수 있는 반면, 화물을 변경하면 캐리어(4 )에 대한 생물학적 반응이 변경될 수 있으므로 대표 결과를 산출하지 못할 수 있습니다. 셋째, 많은 운반체는 특정 세포 유형과 상호 작용하고 흡수되도록 설계되었습니다. 담체의 이러한 타겟팅 능력은 그의 치료적 화물 포스트 타겟팅의 성능과 구별될 수 있고 구별되어야 한다. LNP 예를 계속하기 위해 RNA 화물은 매우 강력할 수 있지만 LNP가 세포에 결합하여 내재화되고 RNA를 방출할 수 없는 경우 다운스트림 기능 효과가 관찰되지 않습니다. 이는 특히 T 세포5와 같이 형질감염하기 어려운 세포 유형을 표적으로 하는 담체에게 문제가 될 수 있습니다. 반대로 LNP는 매우 효과적으로 표적화할 수 있지만 RNA 화물은 작동하지 않을 수 있습니다. 화물 기능만 측정하는 다운스트림 분석으로는 이 두 가지 상황을 구별할 수 없으므로 운반체 약물 전달 시스템의 개발 및 최적화가 복잡해집니다.
이 작업에서는 캐리어 연관성 을 절대적으로 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 연관성은 실험적으로 측정된 운반체와 세포 간의 상호 작용 정도를 나타내는 용어입니다. 결합은 막 결합과 내재화를 구별하지 않는다 – 담체는 세포 표면에 결합되어 있거나 세포가 그것을 내재화했기 때문에 연관될 수 있다. 연관성은 일반적으로 세포-담체 배양 실험의 일부로 측정됩니다. 역사적으로 연관성은 임의의 형광 단위 (일반적으로 “중간 형광 강도”또는 MFI) 또는 “퍼센트 연관성”으로보고되었으며, 그 한계는 이전에 논의되었습니다6. 요컨대, 이러한 측정은 실험 프로토콜, 유세포분석기 설정 및 다른 운반체의 라벨링 강도의 차이로 인해 실험, 실험실 및 약물 운반체 간에 비교할 수 없습니다. 세포 분석기를 보정하여 MFI의 상대적 측정을 형광7의 절대 정량적 측정으로 변환함으로써 전자를 극복하기위한 노력이 이루어졌습니다. 그러나, 이 방법은 다양한 캐리어의 라벨링 강도에서의 가변성을 설명하지 않으며, 따라서, 선택(8)의 타겟 셀에서 다양한 캐리어 성능의 합리적인 비교를 허용하지 않는다.
여기서, 상대적이고 임의의 형광 단위로부터 “세포당 운반체의 수”의 절대 정량적 메트릭으로 실질적으로 변환하는 방법은 소수의 추가 특성화 실험을 수행하여 입증된다. 캐리어 농도의 다른 메트릭이 필요한 경우(예: 셀당 캐리어 질량 또는 셀당 캐리어 부피), 캐리어 특성화가 수행된 경우 셀당 캐리어에서 변환하는 것이 간단합니다. 간결함과 전문 용어를 피하기 위해 이 작업에서 “운반체”라는 단어는 방대한 약물 전달 구조를 지칭하는 데 사용됩니다. 이러한 정량화 기술은 나노 공학 금 입자 또는 생체 공학 박테리아에 적용되는지 여부에 관계없이 동일하게 적용됩니다.
몇 가지 사실은 임의의 형광 단위에서 세포당 운반체로의 변환을 가능하게 합니다. 첫째, 측정된 형광 강도는 형광단9(또는 형광 표지된 담체)의 농도에 비례하며, 형광이 기기의 검출 한계 내에 있고 기기 설정이 동일하다고 가정합니다. 따라서 캐리어의 형광과 샘플의 형광을 알고 있으면 모든 측정이 동일한 설정 및 조건에서 수행되면 해당 샘플에 얼마나 많은 캐리어가 존재하는지 확인할 수 있습니다. 그러나 특히 더 작은 캐리어의 경우 동일한 설정으로 동일한 기기에서 캐리어 형광, 세포 자가형광 및 캐리어와 연결된 세포 형광을 측정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이 경우 한 기기에서 측정된 형광과 다른 기기에서 측정된 형광 간에 변환할 수 있도록 하는 두 번째 요구 사항이 있습니다. 이를 위해 형광단 농도의 표준 곡선을 설정하여 등가 가용성 형광체 분자(MESF) 표준9를 활용하여 두 기기의 형광 강도를 측정할 수 있습니다. 그런 다음 비세포분석기에서 대량으로 운반체 형광을 측정할 수 있으며, 이는 모든 크기 또는 특성의 운반체에서 수행할 수 있는 측정입니다. 이러한 벌크 정량화가 알려진 농도의 담체 현탁액에 대해 수행될 때, 샘플의 세포당 담체의 수가 다시 한번 계산될 수 있다.
이 작업은 캐리어 연관성을 측정하는 프로세스 (측정 된 형광 강도에 의해 결정됨)를 보여 주지만, 유사한 프로토콜이 세포-캐리어 상호 작용의 다른 측정 (예 : 내재화 된 캐리어와 막 결합 캐리어를 구별하는 실험 프로토콜)에 대해 수행 될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 연관성이 비형광 분석(예: 질량 세포분석을 통해)을 통해 측정된 경우 대체로 동일합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
약물 운반체와 세포 간의 상호 작용을 특성화하는 것은 새로운 약물 전달 시스템의 개발에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 구체적으로, 다양한 캐리어 구축물의 합리적인 평가 및 비교를 허용하기 위해, 표적 및 비표적 세포와 상호작용하는 상기 캐리어의 성능의 절대적인 정량화가 중요하다. 이 프로토콜은 약물 운반체와 함께 작업하는 모든 연구자가 세포-운반체 결합에 대한 상대적 반정량적…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 (NHMRC; 프로그램 보조금 번호 GNT1149990), 호주 HIV 및 간염 바이러스 연구 센터 (ACH2) 및 Réjane Louise Langlois의 재산에서 선물. FC는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) 수석 수석 연구 펠로우십(GNT1135806)의 상을 수상했습니다. 그림 1 과 그림 2 는 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
Materials
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
Referencias
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
