Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

Summary

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Abstract

Avec une efficacité, une précision et une facilité exceptionnelles, le système CRISPR / Cas9 a considérablement amélioré l’édition du génome dans la culture cellulaire et les expériences sur des animaux de laboratoire. Lors de la génération de modèles animaux, l’électroporation des zygotes offre une efficacité, une simplicité, un coût et un débit supérieurs à la méthode de référence de la micro-injection. L’électroporation est également plus douce, avec une plus grande viabilité, et délivre de manière fiable des ribonucléoprotéines (RNP) Cas9 / ARN monoguide (sgRNA) dans les zygotes de souches de souris de laboratoire courantes (par exemple, C57BL / 6J et C57BL / 6N) qui approche 100% d’efficacité de livraison. Cette technique permet des mutations d’insertion/délétion (indels), des mutations ponctuelles, la délétion de gènes entiers ou d’exons, et de petites insertions dans la plage de 100-200 bp pour insérer LoxP ou des étiquettes courtes comme FLAG, HA ou V5. Bien qu’en constante amélioration, nous présentons ici l’état actuel de CRISPR-EZ dans un protocole qui comprend la production d’ARNg par transcription in vitro , traitement embryonnaire, assemblage RNP, électroporation et génotypage d’embryons préimplantatoires. Un chercheur de niveau supérieur avec une expérience minimale de la manipulation d’embryons peut obtenir des embryons génétiquement modifiés en moins de 1 semaine en utilisant ce protocole. Ici, nous proposons une méthode simple, peu coûteuse, efficace et de grande capacité qui pourrait être utilisée avec des embryons de souris.

Introduction

L’édition du génome chez la souris vivante a été considérablement simplifiée et est devenue accessible et plus abordable depuis l’émergence de l’édition CRISPR ^1,2,3. Les premières tentatives d’édition animale ont utilisé la micro-injection pour délivrer l’ARNm/ARNsg CRISPR Cas9 dans des embryons au stade pronucléaire ^4,5,6. Bien que la micro-injection soit assez efficace, la quantité de pratique requise pour la maîtriser pleinement pourrait ne pas convenir aux stagiaires et aux étudiants et nécessite également un équipement coûteux qu’un laboratoire modestement financé n’est pas en mesure de se permettre. La micro-injection est normalement effectuée par des techniciens experts dans des installations transgéniques dont les horaires et les prix des services limitent le taux pour de nombreux chercheurs. Une approche plus accessible est celle de l’électroporation, qui s’est avérée très efficace pour l’administration de l’ARNm/ARNsg Cas9 CRISPR dans des embryons au stade pronucléaire⁷. D’autres améliorations dans les stratégies d’édition et de livraison du génome CRISPR suggèrent que les RNP pré-assemblés déjà engagés avec des sgRNA peuvent être un moyen efficace de réduire le mosaïcisme⁸.

La raison d’être de l’élaboration et de l’utilisation de ce protocole était de contourner bon nombre des limites et des obstacles associés à la micro-injection. Comme son nom l’indique, une méthode simple, interne et rentable qui pourrait rapidement déterminer si des conceptions d’ARNg non testées vaudraient la peine d’être utilisées lors d’une expérience de micro-injection serait une étape de contrôle de la qualité de premier passage très pratique (Figure 1). Bien que cette méthode ne puisse pas remplacer la microinjection pour des stratégies plus complexes, comme l’introduction de longues séquences d’ADN de donneur pour des résultats basés sur la recombinaison, elle est idéale pour les stratégies moins complexes telles que les petites délétions ou insertions et le marquage des gènes. Cette méthode convient aux chercheurs ayant des compétences de base en manipulation d’embryons qui ont des besoins d’édition simples, qui souhaitent tester leur hypothèse dans le délai de développement préimplantatoire ou préfèrent tester les ARNg dans les embryons avant de prendre rendez-vous avec un spécialiste de la micro-injection. Ici, les réactifs d’édition sont délivrés transitoirement dans des embryons au stade pronucléaire sous forme de RNP Cas9 / sgRNA par électroporation (une série d’impulsions électriques) pour maximiser l’efficacité tout en diminuant le mosaïcisme⁸. En utilisant une méthode de génotypage embryonnaire, les résultats d’édition sont disponibles en environ 1 semaine⁹, réduisant ainsi le besoin de diverses applications de micro-injection à un coût considérablement réduit.

L’efficacité de cette méthode culmine au stade embryonnaire pronucléaire, lorsque l’embryon n’a pas encore fusionné les pronuclei maternel et paternel ou n’est pas encore entré en phase S (Figure 2). La superovulation est utilisée pour maximiser le nombre de zygotes mais produit à la fois des zygotes pronucléaires et des œufs non fécondés. Les zygotes sains peuvent également être présélectionnés avant l’électroporation pour augmenter l’efficacité globale. Comme d’autres protocoles d’électroporation ont efficacement édité les zygotes sans qu’il soit nécessaire d’inclure une étape similaire 7,10,11,12,13,14,15^, une étape facultative de ce protocole est la légère érosion de la zone pellucide (ZP). Le ZP est une couche de glycoprotéine qui facilite la liaison des spermatozoïdes, la réponse acrosomique et la fécondation autour des embryons au stade pronucléaire. D’après notre expérience, nous avons constaté qu’une légère érosion à base d’acide du ZP fournit une administration fiable de l’électroporation Cas9 RNP avec seulement un impact marginal sur la viabilité.

Nous avons observé des taux d’administration de RNP allant jusqu’à 100% d’efficacité par électroporation dans des souches de souris couramment utilisées dans la recherche comme C57BL / 6J et C57BL / 6N ^9,16. Des groupes indépendants ont également mis au point des procédures basées sur l’électroporation avec des rendements supérieurs ou équivalents à la microinjection 11,12,13,14,15,17, avec des protocoles d’électroporation fonctionnant bien chez le rat^18,19, le porc 20,21,22 et la vache ²³ , nous suggérons donc aux lecteurs de comparer les protocoles pour trouver les conditions qui répondent le mieux à leurs besoins expérimentaux et d’équipement. Le système décrit ici utilise des matériaux et des équipements communs, ne nécessitant que des compétences de base en manipulation d’embryons. Cette technique est efficace pour une gamme de stratégies de révision, ce qui rend cette méthode largement accessible à la communauté de la recherche.

La conception de petits ARN guides idéaux (ARNsg) est essentielle pour une édition efficace. Nous recommandons de dépister deux à trois stratégies d’ARNg par site cible directement dans les embryons de souris, en particulier si la génération de lignées de souris est souhaitée. Une fois conçues, les méthodes sans clonage comme la transcription in vitro (IVT) pour produire des sgRNA de haute qualité sont recommandées³. Les RNP et les ARNg sont mélangés avec 30 à 50 embryons traités au stade pronucléaire et exposés à une série d’impulsions électriques pour perméabiliser d’abord temporairement la ZP et la membrane cellulaire, puis pour maintenir les pores ouverts et électrophorèse les RNP à travers le zygote²⁴. Après optimisation, nous avons constaté que six impulsions de 3 ms à 30 V pour les embryons en vrac (~50) étaient optimales pour l’efficacité et la viabilité de l’édition, fournissant une livraison très efficace de Cas9 / sgRNA RNP ^9,16,25. Les événements d’édition dans la morula de souris individuelle peuvent être confirmés à l’aide d’une variété de stratégies de validation communes à l’édition CRISPR, telles que le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP), la digestion de l’endonucléase T7 et le séquençage de Sanger de la région d’intérêt²⁶.

La méthode actuelle est la plus appropriée pour les schémas d’édition simples (Figure 3), tels que l’insertion/suppression (indels), les suppressions de la taille d’un exon de l’ordre de 500-2000 pb, et la livraison de mutations ponctuelles et de petites insertions telles que les balises C- ou N-Terminal (par exemple, FLAG, HA ou V5)^9,16,27. Le potentiel d’édition complexe du génome, comme de grandes insertions de marqueurs fluorescents ou d’allèles conditionnels, reste incertain et fait actuellement l’objet d’améliorations à venir.

Cette méthode est facilement maîtrisable et peut être utilisée pour tester rapidement les ARNg dans des embryons de souris en culture en 1 semaine⁹ (Figure 1). Ce travail présente un protocole en six étapes, qui comprend 1) la conception de l’ARNg; 2) synthèse de l’ARNg; 3) la superovulation et l’accouplement; 4) la culture, la collecte et le traitement d’embryons; 5) assemblage et électroporation RNP; 6) culture embryonnaire et génotypage. Des informations sur tous les matériaux utilisés sont fournies (Tableau des matériaux). En tant que contrôle positif, les réactifs pour modifier le locus ^9,16 de la tyrosinase (Tyr) ont été inclus dans le tableau supplémentaire 1.

Protocol

Tous les soins et l’utilisation des animaux tout au long de ce protocole respectaient les politiques de la Loi sur le bien-être des animaux, le Guide ILAR pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et suivaient les directives de l’AVMA pour l’euthanasie et les directives et politiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie. Le protocole de soin et d’utilisation des animaux a été examiné et approuvé par l’IACUC de l’Unive…

Representative Results

Cette méthode génère plus de 100 μg d’ARNg (20 μL à >concentration de 6 000 ng/L) pour un assemblage efficace de RNP Cas9/sgRNA. La méthode de superovulation de routine décrite ici produit généralement 10 à 20 embryons viables par femelle bouchée. En raison des erreurs de manipulation et des pertes typiques associées à la manipulation des embryons, on s’attend à ce que 80% des embryons soient fécondés, viables et en excellent état après électroporation. Pour aider les chercheurs à exécuter une e…

Discussion

Présenté ici est une technologie d’édition du génome de souris simple et très efficace. L’électroporation peut être utilisée pour générer des embryons modifiés en 1-2 semaines (Figure 1) et peut produire des souris éditées en 6 semaines⁹. Par rapport aux protocoles basés sur l’électroporation développés simultanément qui délivrent des RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, la méthode décrite ici est conceptuellement similaire et offre des rendements…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer