Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

Summary

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un’efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Abstract

Con efficienza, precisione e facilità eccezionali, il sistema CRISPR / Cas9 ha migliorato significativamente l’editing del genoma in colture cellulari e esperimenti su animali da laboratorio. Quando si generano modelli animali, l’elettroporazione degli zigoti offre maggiore efficienza, semplicità, costo e produttività come alternativa al metodo gold standard di microiniezione. L’elettroporazione è anche più delicata, con una maggiore vitalità, e fornisce in modo affidabile Cas9 / RNA a guida singola (sgRNA) ribonucleoproteine (RNP) negli zigoti dei comuni ceppi di topo da laboratorio (ad esempio, C57BL / 6J e C57BL / 6N) che si avvicina al 100% dell’efficienza di consegna. Questa tecnica consente mutazioni di inserzione/delezione (indels), mutazioni puntiformi, la delezione di interi geni o esoni e piccole inserzioni nell’intervallo 100-200 bp per inserire LoxP o tag brevi come FLAG, HA o V5. Pur essendo costantemente migliorato, qui presentiamo lo stato attuale di CRISPR-EZ in un protocollo che include la produzione di sgRNA attraverso la trascrizione in vitro , l’elaborazione degli embrioni, l’assemblaggio di RNP, l’elettroporazione e la genotipizzazione degli embrioni preimpianto. Un ricercatore di livello universitario con esperienza minima nella manipolazione degli embrioni può ottenere embrioni geneticamente modificati in meno di 1 settimana utilizzando questo protocollo. Qui offriamo un metodo semplice, a basso costo, efficiente e ad alta capacità che potrebbe essere utilizzato con embrioni di topo.

Introduction

L’editing del genoma nei topi vivi è stato notevolmente semplificato ed è diventato accessibile e più conveniente dall’emergere dell’editing CRISPR ^1,2,3. I primi tentativi di modifica animale hanno utilizzato la microiniezione per fornire mRNA / sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare ^4,5,6. Mentre la microiniezione è abbastanza efficace, la quantità di pratica richiesta per padroneggiarla completamente potrebbe non essere appropriata per tirocinanti e studenti e richiede anche attrezzature costose che un laboratorio finanziato modestamente non è in grado di permettersi. La microiniezione viene normalmente eseguita da tecnici esperti in strutture transgeniche con orari e prezzi di servizio che sono limitanti per molti ricercatori. Un approccio più accessibile è quello dell’elettroporazione, che si è dimostrata abbastanza efficace per la consegna di mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare⁷. Ulteriori miglioramenti nelle strategie di editing e consegna del genoma CRISPR hanno suggerito che gli RNP pre-assemblati già impegnati con sgRNA possono essere un mezzo efficace per ridurre il mosaicismo⁸.

La logica alla base dello sviluppo e dell’uso di questo protocollo era quella di aggirare molte delle limitazioni e degli ostacoli associati alla microiniezione. Come suggerisce il nome, un metodo semplice, interno ed economico che potrebbe determinare rapidamente se vale la pena utilizzare progetti di sgRNA non testati durante un esperimento di microiniezione sarebbe una fase di controllo della qualità di primo passaggio molto conveniente (Figura 1). Mentre questo metodo non può sostituire la microiniezione per strategie più complesse, come l’introduzione di lunghe sequenze di DNA del donatore per risultati basati sulla ricombinazione, è ideale per strategie meno complesse come piccole delezioni o inserzioni e geni di marcatura. Questo metodo è appropriato per i ricercatori con competenze di base di manipolazione embrionale che hanno semplici esigenze di editing, vorrebbero testare la loro ipotesi entro il periodo di tempo dello sviluppo preimpianto o preferiscono testare gli sgRNA negli embrioni prima di fissare un appuntamento con uno specialista di microiniezione. Qui, i reagenti di editing vengono consegnati transitoriamente in embrioni in stadio pronucleare come RNP Cas9 / sgRNA tramite elettroporazione (una serie di impulsi elettrici) per massimizzare l’efficienza diminuendo il mosaicismo⁸. Utilizzando un metodo di genotipizzazione embrionale, i risultati di editing sono disponibili in circa 1 settimana⁹, riducendo così la necessità di varie applicazioni di microiniezione a un costo significativamente ridotto.

L’efficacia di questo metodo raggiunge il picco allo stadio embrionale pronucleare, quando l’embrione non ha ancora fuso i pronuclei materno e paterno o è entrato nella fase S (Figura 2). La superovulazione viene utilizzata per massimizzare il numero di zigoti, ma produce sia zigoti pronucleari che uova non fecondate. Gli zigoti sani possono anche essere preselezionati prima dell’elettroporazione per aumentare l’efficienza complessiva. Poiché altri protocolli di elettroporazione hanno modificato in modo efficiente gli zigoti senza la necessità di includere un passo simile 7,10,11,12,13,14,15^, un passo opzionale di questo protocollo è la leggera erosione della zona pellucida (ZP). La ZP è uno strato glicoproteico che aiuta il legame degli spermatozoi, la risposta degli acrosomiali e la fecondazione che circondano gli embrioni in stadio pronucleare. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che una delicata erosione a base acida della ZP fornisce una consegna affidabile dell’elettroporazione Cas9 RNP con un impatto solo marginale sulla vitalità.

Abbiamo osservato tassi di rilascio di RNP fino al 100% di efficienza tramite elettroporazione in ceppi di topo che sono comunemente usati nella ricerca come C57BL / 6J e C57BL / 6N ^9,16. Gruppi indipendenti hanno anche sviluppato procedure basate sull’elettroporazione con efficienze superiori o corrispondenti alla microiniezione 11,12,13,14,15,17, con protocolli di elettroporazione che funzionano bene nel ratto^18,19, nel maiale 20,21,22 e nella mucca ²³ , quindi suggeriamo ai lettori di confrontare i protocolli per trovare le condizioni che meglio si adattano alle loro esigenze sperimentali e di attrezzature. Il sistema qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni, che richiedono solo abilità di manipolazione embrionale di base. Questa tecnica è efficace per una serie di strategie di editing, rendendo questo metodo ampiamente accessibile alla comunità di ricerca.

La progettazione di piccoli RNA guida ideali (sgRNA) è essenziale per un editing efficiente. Raccomandiamo lo screening di due o tre strategie di sgRNA per sito bersaglio direttamente negli embrioni di topo, specialmente se si desidera generare linee di topo. Una volta progettati, si raccomandano metodi privi di clonazione come la trascrizione in vitro (IVT) per produrre sgRNA di alta qualità³. Gli RNP e gli sgRNA sono mescolati con 30-50 embrioni in stadio pronucleare processati ed esposti a una serie di impulsi elettrici per prima permeabilizzare temporaneamente la ZP e la membrana cellulare, con impulsi successivi per mantenere i pori aperti ed elettroforese gli RNP attraverso lo zigote²⁴. Dopo l’ottimizzazione, abbiamo scoperto che sei impulsi da 3 ms a 30 V per embrioni di massa (~ 50) erano ottimali per l’efficacia e la vitalità dell’editing, fornendo una consegna altamente efficiente di Cas9 / sgRNA RNP ^9,16,25. Gli eventi di editing nella morula di topo possono essere confermati utilizzando una varietà di strategie di convalida comuni per l’editing CRISPR, come il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), la digestione dell’endonucleasi T7 e il sequenziamento Sanger della regione di interesse²⁶.

Il metodo attuale è più appropriato per semplici schemi di editing (Figura 3), come inserimento/delezioni (indel), delezioni di dimensioni esone dell’ordine di 500-2000 bp e la consegna di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni come tag C- o N-terminali (ad esempio, FLAG, HA o V5)^9,16,27. Il potenziale per l’editing del genoma complesso, come grandi inserzioni di tag fluorescenti o alleli condizionali, rimane incerto ed è attualmente al centro dei prossimi miglioramenti.

Questo metodo è facilmente padroneggiabile e può essere utilizzato per testare rapidamente gli sgRNA in embrioni di topo in coltura in 1 settimana⁹ (Figura 1). Presentato in questo lavoro è un protocollo in sei fasi, che include 1) progettazione di sgRNA; 2) sintesi di sgRNA; 3) superovulazione e accoppiamento; 4) coltura, raccolta e trattamento di embrioni; 5) assemblaggio RNP ed elettroporazione; 6) coltura embrionale e genotipizzazione. Vengono fornite informazioni su tutti i materiali utilizzati (Tabella dei materiali). Come controllo positivo, i reagenti per modificare il locus della tirosinasi (Tyr) ^9,16 sono stati inclusi nella tabella supplementare 1.

Protocol

Tutta la cura e l’uso degli animali in questo protocollo hanno aderito alle politiche dell’Animal Welfare Act della Guida ILAR per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e hanno seguito le linee guida dell’AVMA per l’eutanasia e le linee guida e le politiche del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università della Pennsylvania. Il protocollo di cura e utilizzo degli animali è stato esaminato e approvato dall’Università della Pennsylvania IACUC per questo progetto. Per una questi…

Representative Results

Questo metodo genera più di 100 μg di sgRNA (20 μL a concentrazione di >6.000 ng/L) per un efficiente assemblaggio di RNP Cas9/sgRNA. Il metodo di superovulazione di routine qui descritto produce tipicamente 10-20 embrioni vitali per femmina collegata. A causa degli errori di manipolazione e delle perdite tipiche associate alla manipolazione degli embrioni, si prevede che l’80% degli embrioni sia fecondato, vitale e in condizioni eccellenti dopo l’elettroporazione. Per aiutare i ricercatori a eseguire un esperimento d…

Discussion

Qui viene presentata una tecnologia di editing del genoma del topo semplice e altamente efficiente. L’elettroporazione può essere utilizzata per generare embrioni modificati in 1-2 settimane (Figura 1) e può produrre topi modificati entro 6 settimane⁹. Rispetto ai protocolli basati sull’elettroporazione sviluppati contemporaneamente che forniscono RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, il metodo qui descritto è concettualmente simile e offre efficienze nello stesso <sup cl…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer