Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines
Summary
L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.
Abstract
La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.
Introduction
La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique 1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale 3,4. La nécroptose est initiée par l’activation de RIPK3 à la suite d’interactions médiées par le motif d’interaction homotypique (RHIM) RIP avec l’une des trois molécules activatrices en amont : RIPK1 (lors de l’engagement du récepteur TNF 1 [TNFR1]), l’interféron-β induisant un adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF; lors de l’engagement des récepteurs de type Toll 3 et 4), ou le capteur d’acide nucléique antiviral Protéine de liaison à l’ADN-Z 1 (ZBP1)1,2 . La signalisation de la nécroptose se déroule par une série d’événements de phosphorylation commençant par l’autophosphorylation de RIPK3. L’autophosphorylation de RIPK3 humain à la sérine (S)227 à l’intérieur de son domaine kinase est une condition préalable à la nécroptose en permettant l’interaction avec MLKL et est couramment utilisée comme marqueur biochimique de l’activation humaine de RIPK3 et de la mort cellulaire nécroptotique 1,5. Une fois activé, RIPK3 phosphoryle la boucle d’activation de MLKL à la thréonine (T)357 et S3581. Cela provoque une modification de la conformation MLKL, entraînant une exposition du domaine du faisceau à quatre hélices N-terminal. MLKL s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il forme un pore par l’insertion des quatre faisceaux hélicoïdaux exposés dans la bicouche lipidique, conduisant finalement à la mort cellulaire 2,6.
ZBP1 est un capteur d’acide nucléique antiviral qui reconnaît les acides nucléiques gauchers de forme Z, y compris l’ARN double brin dans la conformation Z (ARN-Z). La liaison de l’ARN-Z se produit via deux domaines Zα positionnés à l’extrémité N de ZBP1. On pense que l’ARN-Z s’accumulant lors de l’infection par l’ARN et le virus de l’ADN engage directement ZBP1 7,8. ZBP1 activé recrute RIPK3 par le biais de ses RHIM centraux et induit une mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose 9,10. Les virus ont adopté de nombreux mécanismes d’échappement pour contrer la nécroptose de la cellule hôte induite par ZBP11. Par exemple, la sous-unité 1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1), connue sous le nom de ICP6 et codée par UL39, héberge RHIM à son extrémité N qui interfère avec l’activation de RIPK3 médiée par ZBP1 dans les cellules humaines12,13,14,15. ZBP1 non seulement restreint la réplication virale, mais des études sur la souris ont montré que l’activation de ZBP1 provoque des maladies inflammatoires et stimule l’immunité contre le cancer 16,17,18,19,20,21. Les protocoles qui détectent les événements de signalisation se produisant pendant la nécroptose induite par ZBP1 dans les cellules humaines sont donc utiles pour évaluer le rôle de ZBP1 dans ces processus.
L’amplification du signal tyramide (TSA), également appelée dépôt de rapporteur catalysé (CARD), a été développée pour améliorer la limite de détection et le rapport signal sur bruit dans les immunoessais à base d’anticorps. Au cours de la TSA, n’importe quel anticorps primaire peut être utilisé pour détecter l’antigène d’intérêt. La peroxydase de raifort (HRP), couplée à un anticorps secondaire, catalyse l’accumulation locale de radicaux tyramide biotinylés en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux biotine-tyramide activés réagissent ensuite avec les résidus de tyrosine proximale pour former des liaisons covalentes. Les substrats potentiels tyramide-biotine comprennent l’antigène lui-même, les anticorps primaires et secondaires et les protéines voisines. Ainsi, alors que la TSA améliore considérablement la sensibilité du test, une partie de sa résolution spatiale est perdue. Dans une dernière étape, les molécules de biotine sont détectées à l’aide de streptavidine marquée par fluorescence. La réaction HRP dépose de nombreuses molécules de tyramide-biotine sur ou à proximité de l’antigène d’intérêt. Cela augmente considérablement le nombre de sites de liaison streptavidine-fluorochrome, amplifiant ainsi considérablement la sensibilité du test (Figure 1). Alternativement, le tyramide peut être directement couplé à un fluorochrome, éliminant ainsi le besoin de fluorophores couplés à la streptavidine. L’immunohistochimie des protéines et l’hybridation in situ ADN/ARN ont été parmi les premières méthodes par lesquelles la TSA a été utilisée pour améliorer l’intensité du signal22,23. Plus récemment, la TSA a été combinée avec la cytométrie de flux intracellulaire24 et la spectrométriede masse 25.
Ici, nous présentons un protocole pour détecter la sérine 227 humaine phosphorylée RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) et la MLKL humaine phosphorylée (p-MLKL [S358]) lors de l’activation de ZBP1 par infection à HSV-1 par microscopie d’immunofluorescence. Nous utilisons une lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain HT-29 sensible à la nécroptose qui a été transduite pour exprimer de manière stable ZBP1 humain. Ces cellules ont été infectées par une souche HSV-1 exprimant une protéine mutante ICP6 (HSV-1ICP6 mutRHIM) dans laquelle quatre acides aminés centraux du RHIM viral (VQCG) ont été remplacés par des alanines (AAAA), rendant ainsi l’ICP6 incapable de bloquer la nécroptose médiée par ZBP113,14,15. Pour surmonter le problème du faible rapport signal/bruit des anticorps actuellement disponibles dans le commerce dirigés contre p-RIPK3 et p-MLKL dans l’immunomarquage26, nous effectuons une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) (Figure 1), qui se traduit par une détection robuste de p-RIPK3 humain (S227) et améliore la sensibilité de détection du p-MLKL humain (S358) d’un ordre de grandeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL26. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le VIB Bioimaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments. J.N. est soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation pour la recherche de Flandre (FWO). La recherche dans le groupe J.M. a été soutenue par une bourse Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), une subvention de recherche junior (G031022N) de la Fondation de recherche Flanders (FWO), une bourse de preuve de concept pour jeunes chercheurs du CRIG et par l’Université de Gand. La recherche dans le groupe P.V. a été soutenue par EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), les consortiums CRIG et GIGG et VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
Referencias
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