리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독
Summary
여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
세포가 PFT로 인한 막 손상에 저항하기 때문에 기공 형성 독소(PFT)의 기능과 메커니즘을 이해하는 것은 어렵습니다. 생물 물리학 적 접근법은 기공 형성을 이해하는 데 도움이되지만, 종종 막 지질과 단백질의 완전한 보완이 부족한 환원 주의적 접근법에 의존합니다. 배양 된 인간 세포는 대체 시스템을 제공하지만 복구 메커니즘의 복잡성과 중복으로 인해 특정 메커니즘을 식별하기가 어렵습니다. 대조적으로, 피부 리슈만편모충증을 담당하는 인간 원생동물 병원체인 리슈만편모충은 복잡성과 생리학적 관련성 사이의 최적의 균형을 제공합니다. L. major 는 유전적으로 다루기 쉽고 시험관 내에서 고밀도로 배양될 수 있으며 섭동이 감염에 미치는 영향은 확립된 쥐 모델에서 측정할 수 있습니다. 또한 L. major 는 포유류와 구별되는 지질을 합성하여 막 역학을 변경할 수 있습니다. 막 역학의 이러한 변화는 가장 잘 특성화된 독소 계열인 콜레스테롤 의존성 세포용해제(CDC)의 PFT로 프로젝션할 수 있습니다. CDC는 리슈만편모충 막의 에르고스테롤에 결합하여 L. major 프로마스티고테를 죽일 수 있으며, 이는 L. major 가 PFT 기능의 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 적합한 모델 시스템임을 나타냅니다 . 이 연구는 기생충 배양, 지질 감수성 평가를위한 유전 도구, 막 결합 분석 및 세포 사멸 분석을 포함하여 L. 주요 프로마스티고트에서 PFT 기능을 테스트하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 진화적으로 다양한 유기체와 지질 조직의 공통점에 걸쳐 PFT 기능을 이해하기 위한 강력한 모델 시스템으로 L. major 를 신속하게 사용할 수 있도록 합니다.
Introduction
기공 형성 독소(PFT)는 박테리아 독소의 가장 큰 계열이지만1, 세포를 천공하고 파괴하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 가장 잘 연구된 모공 형성 독소 계열은 콜레스테롤 의존성 세포질(CDC)입니다. CDC는 주로 괴사 성 근막염의 원인균 인 Streptococcus pyogenes2를 포함한 그람 양성 박테리아에 의해 합성됩니다. S. pyogenes 는 숙주 세포의 원형질막에 있는 스테롤에 단량체로 결합하여 올리고머화하고 ~20-30nm 기공을 막1에 삽입하는 CDC 스트렙톨리신 O(SLO)를 분비합니다. 이 과정에서 지질이하는 역할은 아직 결정되지 않았습니다.
지질-CDC 상호작용을 연구하는 한 가지 접근법은 화학적으로 정의된 리포좀을 사용하는 것입니다. 정의된 리포좀은 독소 결합 및 기공 형성3,4을 유지하는 데 필요한 지질의 역치에 대한 정보를 제공하지만 세포 기능을 완전히 요약하지는 않습니다. 예를 들어, 재구성된 리포좀은 포유류 숙주의 지질 비대칭성과 독소에 대한 반응의 지질 변형이 부족합니다5. 리포좀에 대한 한 가지 대안은 포유류 세포주를 사용하는 것입니다. 이러한 세포주는 생리학적으로 더 관련이 있지만 독소 감지 및내성 메커니즘에는 상당한 수준의 중복성이 있습니다2. 결과적으로 CDC에 저항하는 데 사용되는 복구 경로는 제대로 결정되지 않은 상태로 남아 있습니다. 특히,Ca 2+ 유입은 막 복구1의 주요 활성화 제입니다. Ca 2+ 유입의 하류에는 세라마이드 의존적 복구 6,7 및 MEK 의존적 복구 경로6를 포함한 여러 경로가 참여합니다. 이러한 경로는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT)8 및 부속신 6,9,10을 포함한 다른 단백질 이펙터와 상호 작용합니다. 포유류 세포에서 이러한 경로를 해부하는 것은 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 중복성으로 인해 어렵습니다.
복구 경로를 해부하기 위해 복잡성과 단순성의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 Leishmania 속의 원생 동물 병원체와 같은 더 간단한 유기체를 사용하는 것입니다. 리슈만편모충 sp. 인간과 다른 동물에서 리슈만편모충증을 유발합니다. 리슈만편모충증은 종 및 기타 요인에 따라 피부 리슈만편모충증(자가 제한된 피부 병변)에서 치명적인 내장 리슈만편모충증(간비장비대)에 이르기까지 다양합니다11. 피부 리슈만편모충증의 원인균인 리슈만편모충은 모래편모충 벡터를 통해 인간에게 전염되며 리슈만편모충 기능과 감염을 이해하는 데 사용됩니다12. 또한, 리슈만편모충 sp. 아르 디제닉12. 그들은 amastigotes라고 불리는 세포 내 포유류 대 식세포 기생충과 모래 파리12에서 자유롭게 수영하는 편모 모양의 프로 마스 티고트로 존재합니다. L. 주요 프로마스티고테는 M199와 같은 혈청 보충 배지에서 고밀도13으로 배양할 수 있습니다. 프로마스티고테는 또한 유전적으로 다루기 쉽습니다. 지질 생합성 경로를 표적으로 하는 것을 포함하여 많은 유전자 녹아웃이 존재합니다13. 이러한 녹아웃은 Balb/c 마우스13의 감염을 통해 감염성 및 병변 발달의 성장 및 차이에 대해 평가할 수 있습니다.
리슈만편모충 배양의 상대적 용이성과 지질 생합성 녹아웃의 범위 외에도 기생충은 포유류보다 더 단순한 게놈을 가지고 있습니다. 리슈만편모충의 가장 잘 특성화된 종은 L. major로, 지질 대사에 결함이 있는 돌연변이와 같은 기존의 많은 유전 도구를 가지고 있습니다14. 특히, 많은 복구 단백질이 없습니다. L. major는 아넥신과 같은 주요 포유류 복구 단백질에 대해 현재까지 확인된 동족체가 없습니다. 이것은 포유류 시스템의 복잡성없이 진화 적으로 보존 된 복구 경로의 특성화를 가능하게합니다. 그러나 수리 경로는 현재까지 리슈만편모충에서 특성화되지 않았습니다. 동시에 MEK 경로6과 같은 복구와 관련된 주요 신호 전달 경로는 리슈만편모충 sp.15,16에서 보존되지만 동족체를 검증해야 합니다. 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로는 L. mexicana에서 잘 연구되어 포유류 세포의 세포 내 생존 및 열 안정성에 기여하고 메타 사이클 생성을 제어합니다16. 리슈만편모충 sp.에서는 15개의 MAPK 중 10개가17개로 특성화되었습니다. LmMAPK9 및 LmMAPK13은 보존된 인산화 립 서열에서의 동일성에 기초하여 포유동물 ERK1/2와 가장 유사한 것으로 예측된다. 인산화 립 서열은 포유동물 ERK1/2 및 LmMAPK9 및 LmMAPK13 둘 다에 대해 TEY이다. 그러나, 리슈만편모충 MAPK 중 8개는 TDY 인산화 모티프15를 갖는다. 적어도 두 개의 MEK 동족체가 리슈만편모충 sp., LmxMKK18 및 MEKK-관련 키나아제(MRK1)19에서 확인되었다. 이것은 리슈만편모충에서 확인된 통찰력이 포유류 시스템으로 번역될 수 있음을 시사합니다. 포유류 시스템으로 번역되지 않는 경우 리슈만편모충증 치료를 위한 치료 표적을 나타냅니다.
L. major promastigotes를 사용하여 막 복구 및 독소와의 상호 작용을 연구하려면 중간 처리량 기술이 필요합니다. 고해상도 라이브 셀 이미징을 사용하면 표지된 단백질과 막을 실시간으로 시각화할 수 있지만 처리량이 적고 세포 생존을 측정하지 못할 수 있습니다. 중간 처리량 생존력 분석에는 유세포 분석으로 측정한 염료 흡수, 미토콘드리아 활성 측정 또는 젖산 탈수소효소(LDH)와 같은 세포 단백질의 방출이 포함됩니다. 포유류 세포에서, LDH 분석은 세포 사멸을 정량적으로 측정하지 않는다20. 또한, LDH 방출 또는 미토콘드리아 활성과 같은 인구 기반 분석은 강력한 단일 세포 또는 다중 파라미터 분석을 허용하지 않습니다20. 대조적으로, 유세포분석 기반 분석은 다중 파라미터 단일 세포 분석을 가능하게 합니다(20). 그러나 이러한 분석은 독소 생물학 또는 L. 주요 프로마스티고테의 독소에 대한 반응을 이해하는 데 적용되지 않았습니다.
이 연구에서 SLO는 L. major promastigotes와 더 간단한 Tyrode 완충액을 배양하는 데 일상적으로 사용되는 M199 배지의 두 가지 다른 완충액에서 L. major의 스핑고지질 널 돌연변이의 원형질막 섭동을 이해하는 도구로 사용됩니다. 중간 처리량 유세포 분석 분석이 설명되고 독소 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 유동 세포분석 분석으로부터의 데이터는LC50 값을 결정하기 위해 로지스틱 곡선으로 모델링된다. 이러한 정보를 이용하여, SLO의 전분해 용량을 결정하여 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MAPK 항체를 검증할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 인간 병원균 리슈만편모충 전공 을 모델 시스템으로 사용하여 PFT의 분자 메커니즘과 기능을 연구하는 방법을 설명했습니다. 단일 세포 생존율을 측정하기 위한 배지-처리량 유세포분석-기반 세포독성 분석법이 개발되었다. LC50 값은 로지스틱 모델링을 사용하여 용량-반응 곡선에서 계산할 수 있기 때문에 모집단 수준에서 생존력이 정량적입니다. 원리 증명으로 유?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Keyel 및 Zhang 연구실 구성원에게 감사하고 싶습니다. 저자는 시설 사용에 대해 예술 과학 대학 현미경에 감사드립니다.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
Referencias
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