Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальном геноме методом пиросеквенирования
Summary
Пиросеквенирующие анализы обеспечивают надежное и быстрое генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов митохондриальной ДНК в гетероплазматических клетках или тканях.
Abstract
Мутации в митохондриальном геноме (мтДНК) были связаны с генетическими заболеваниями, унаследованными по материнской линии. Тем не менее, интерес к полиморфизмам мтДНК возрос в последние годы из-за недавно разработанной способности создавать модели с помощью мутагенеза мтДНК и нового понимания связи между митохондриальными генетическими аберрациями и распространенными возрастными заболеваниями, такими как рак, диабет и деменция. Пиросеквенирование — это метод секвенирования путем синтеза, который широко используется в митохондриальном поле для рутинных экспериментов по генотипированию. Его относительная доступность по сравнению с методами массового параллельного секвенирования и простота реализации делают его бесценным методом в области митохондриальной генетики, позволяя быстро количественно определять гетероплазмию с повышенной гибкостью. Несмотря на практичность этого метода, его реализация в качестве средства генотипирования мтДНК требует соблюдения определенных руководящих принципов, в частности, чтобы избежать определенных предубеждений биологического или технического происхождения. В этом протоколе изложены необходимые шаги и меры предосторожности при разработке и внедрении пиросеквенирующих анализов для использования в контексте измерения гетероплазмии.
Introduction
Митохондриальный геном существует в виде небольших (16,5 кб) кольцевых молекул (мтДНК), присутствующих во внутреннем компартменте митохондрий, называемом матрицей, и кодирует 13 субъединиц митохондриальной дыхательной цепи, а также тРНК и рРНК, необходимых для их трансляции in situ митохондриальной рибосомой1. Этот геном составляет примерно 1% всех белков, необходимых для функции митохондрий, остальная часть которых кодируется ядерной ДНК (нДНК). Обычно предполагается, что митохондрии происходят в результате эндосимбиотического слияния между альфа-протеобактериальным предком и предковой эукариотической клеткой. Как только этот гипотетический симбиоз произошел, генетическая информация митохондрий постепенно переносилась в ядро в течение эонов, что объясняет вышеупомянутую компактность мтДНК по сравнению с геномами современных цианобактерий2. Такой перенос генов наиболее убедительно подтверждается существованием длинных участков нДНК, которые высоко гомологичны последовательностям, обнаруженным в мтДНК. Эти ядерные митохондриальные последовательности (NUMT) являются распространенным источником неправильной интерпретации во время генотипирования, и необходимо принять определенные меры предосторожности, чтобы избежать ядерных предубеждений при генотипировании мтДНК3 (рис. 1A).
Еще одной отличительной особенностью мтДНК является то, что количество ее копий варьируется в зависимости от типа клетки, насчитывая от десятков до тысяч копий на клетку4. Из-за этой природы множественных копий мтДНК может содержать широкий спектр генотипов в одной клетке, что может привести к более непрерывному распределению аллелей в отличие от дискретных аллелей, связанных с ядерными генами, при рассмотрении зиготности хромосом. Эта гетерогенность митохондриальных аллелей называется митохондриальной гетероплазмией, которая обычно выражается в процентной распространенности данной мутации в процентах от общего количества мтДНК в данной клетке. Гетероплазмию можно противопоставить гомоплазмии, которая относится к уникальному виду мтДНК, присутствующему в клетке.
Измерение митохондриальной гетероплазмии представляет особый интерес при количественном определении доли молекул мтДНК, содержащих патогенные варианты. Такие варианты бывают в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), небольших инделов или крупномасштабных делеций5. Большинство людей гетероплазматичны в отношении патогенных вариантов; однако они не проявляют каких-либо клинических фенотипов, которые часто проявляются только при более высоких уровнях гетероплазмии патогенной мтДНК в явлении, называемом пороговым эффектом6. Хотя значения, связанные с патогенностью, сильно зависят от природы патогенной мутации и ткани, в которой она происходит, они обычно лежат выше 60% гетероплазмии7.
Существует несколько областей исследований, в которых распространено митохондриальное генотипирование. В области медицины тестирование или количественная оценка мутаций мтДНК может служить диагностическим критерием митохондриальных заболеваний, многие из которых имеют аберрации мтДНК в качестве источника5. В дополнение к изучению патогенных мутаций человека, распространенность животных моделей, содержащих патогенные SNP в мтДНК, вероятно, увеличится, учитывая недавнее появление редактирования митохондриальных оснований, обеспечиваемого митохондриально целевыми редакторами цитозиновых оснований, полученных из DddA (DdCBE)8, и деаминазами на основе TALE (TALED) для редактирования адениновых оснований9. Этот подход будет играть важную роль в понимании взаимодействия между аберрантными митохондриальными генотипами и возникающими в результате дисфункциями. Также продолжаются научные исследования по ремоделированию митохондриального генома для конечного использования в качестве терапевтической стратегии при митохондриальных заболеваниях человека с помощью подхода, известного как сдвиг гетероплазмии. Эта область исследований в первую очередь включает направление мутационно-специфических нуклеаз в митохондриальный матрикс; это приводит к преимущественной деградации патогенной мтДНК, что приводит к спасению фенотипа10,11,12,13. Любые эксперименты, связанные с ремоделированием митохондриального генотипа, требуют надежного количественного метода для оценки сдвигов гетероплазмии.
Для генотипирования мтДНК используется широкий спектр методов, которые варьируются в зависимости от характера мутации. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) более точны, когда речь идет о количественном определении SNP в мтДНК; Однако эти методы остаются непомерно дорогими для рутинной количественной оценки митохондриальной гетероплазмии, особенно если количество образцов невелико. Секвенирование по Сэнгеру также может позволить обнаруживать SNP; Однако этот подход не является количественным и часто не позволяет обнаружить низкие уровни гетероплазмии или может быть неточным при оценке высоких гетероплазмий. Пиросеквенирование, как анализ, который включает минимальную подготовку и позволяет быстро количественно определить гетероплазмию для любого образца мтДНК, предлагается в качестве подходящего компромисса между этими двумя крайностями. Этот метод регулярно использовался для количественной оценки митохондриальных SNP многочисленными исследователями в различных контекстах, включая судебно-медицинский анализ 14,15, клинический диагноз16 или генотипирование мтДНК из отдельных клеток17.
Этот анализ включает в себя первый этап преамплификации ПЦР области, фланкирующей SNP в мтДНК, за которым следует анализ секвенирования путем синтеза с использованием одной цепи ранее сгенерированного ампликона. Один из двух праймеров, используемых на стадии преамплификации, должен быть биотинилирован на 5′-конце, что позволит пиросеквенирующему аппарату изолировать одну цепь ДНК, которая будет использоваться в качестве матрицы для реакции секвенирования. Затем третий праймер для секвенирования отжигают на сохраненную биотинилированную цепь, что позволяет зарождающемуся синтезу ДНК в виде дезоксинуклеотидов распределяться в заранее определенном порядке в реакционную камеру. Пиросеквенсор записывает количество каждого включенного основания на основе люминесцентного считывания, что позволяет проводить относительную количественную оценку мутантных и митохондриальных аллелей дикого типа при синтезе ДНК (рис. 1B). Люминесценция генерируется ферментом люциферазы, который излучает свет в присутствии АТФ, который АТФ-сульфурилаза синтезирует de novo при каждом событии включения из пирофосфатов, высвобождаемых каждым нуклеотидом. Эти две реакции можно резюмировать следующим образом:
1. PPi (от включения нуклеотидов) + APS → АТФ + сульфат (АТФ-сульфурилаза)
2. АТФ + люциферин + О2 → АМФ + РРi + оксилюциферин +СО2 + свет (люцифераза)
Обнаружение адениновых оснований пиросеквенсором без перекрестной реакции АТФ с люциферазой во второй реакции является сложной задачей. Однако это решается с помощью аналога аденина для синтеза ДНК, а именно dATPαS. Несмотря на то, что он не является идеальным субстратом для люциферазы, он производит более сильную люминесценцию по сравнению с тремя другими нуклеотидами, которая регулируется пиросеквенсором в цифровом виде и устанавливается на коэффициент 0,9. Из-за этой присущей изменчивости рекомендуется избегать секвенирования аденина в положении SNP (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
В следующем протоколе подробно описывается метод оценки гетероплазмии мтДНК путем пиросеквенирования и излагаются необходимые меры предосторожности при разработке амплификационных праймеров, чтобы избежать биологической или технической предвзятости при генотипировании SNP в мтДНК. Последнее включает в себя цифровую съемку и выбор наборов праймеров, оптимизацию ПЦР с предварительной амплификацией и, наконец, секвенирование и уточнение анализа. Продемонстрированы два прикладных примера: во-первых, оптимизация наиболее распространенного патогенного варианта человека m.3243A>G18 и, во-вторых, генотипирование клеток эмбриональных фибробластов мыши (MEF), подвергшихся гетероплазменному сдвигу, с использованием технологий, разработанных в лаборатории Минчука в Кембридже 10,11,12,19,20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшим аспектом успеха протокола является предотвращение загрязнений, особенно при использовании небольшого количества исходного материала. Рекомендуется использовать УФ-колпак и фильтрованные наконечники пипеток при подготовке образцов, где это возможно, а также разделять обл?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем благодарность Сильвии Марше (Silvia Marchet) и Констанце Ламперти (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Милан) за подготовку и предоставление цибридных клеток m.3243A>G, используемых в качестве иллюстративных примеров для этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить членов Группы митохондриальной генетики (MRC-MBU, Кембриджский университет) за полезное обсуждение в ходе этого исследования. Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании (MC_UU_00015/4 и MC_UU_00028/3). .А.Н. и.С.-. дополнительно поддерживаются The Lily Foundation и The Champ Foundation соответственно.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
Referencias
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
