Extrahepatische galwegen en galblaasdissectie bij negen dagen oude muisverwijders
Summary
Voor de observatie van muizennenatale galwegaandoeningen zijn een intact galkanaal en een efficiënte voorbereiding vereist. Daarom werd met succes een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het isoleren van het gehele extrahepatische galkanaalsysteem bij muizenne neonaten met behoud van de integriteit van het galkanaal.
Abstract
De dissectie van murine neonatale galwegen is beschreven als moeilijk. Het belangrijkste doel van de beschreven standaard operatieprocedure is de isolatie van het extrahepatische galkanaal (EBD) bij muizennexanen zonder het galkanaal tijdens de bereiding te beschadigen. Vanwege de uitzonderlijk nauwe voorbereiding in vergelijking met de cellijn van cholangiocyten en het oogsten van het gehele extrahepatische galwegsysteem (EBDS), is de beschreven aanpak uiterst nuttig bij het onderzoeken van diermodellen van pasgeboren galwegaandoeningen, zoals galwegesie. Na euthanasie werd de peritoneale holte ontsloten en werden het galwegsysteem, de twaalfvingerige darm en de lever geëxtraheerd met de unieke En-bloc-Resectie (EbR). Het geëxtraheerde monster wordt op een schuimmat geplaatst en de EBD wordt atraumatisch ontleed van verontreinigende cellen zonder noodzakelijke aanraking. De dissectie van de gehele EBDS is een belangrijk voordeel van deze methode. Voorzichtigheid is geboden vanwege de kleine omvang en hoeveelheid galwegweefsel. Met behulp van de beschreven techniek is er geen schade aan de cholangiocyten. Verder is de zuiverheid van de techniek reproduceerbaar (n = 10). Hierdoor kunnen optimaal vergelijkbare monsters worden geoogst. Bovendien wordt geen galwegweefsel beschadigd, omdat elk contact met het galwegsysteem tijdens de voorbereiding kan worden vermeden, waardoor de galvloeistof in de galblaas achterblijft. Het belangrijkste is dat tijdens het uitvoeren van de uiteindelijke galblaas- en galwegdissectie, atraumatische micro-instrumenten slechts licht lateraal van het galkanaal werden gebruikt zonder erin te knijpen. Dit is de sleutel tot een schoon en intact monster en essentieel voor verder histologisch onderzoek of de isolatie van cholangiocyten. Samenvattend stelt de beschreven innovatieve dissectietechniek vooral onervaren operators met de nodige apparatuur in staat om de EBDS zo schoon mogelijk te isoleren.
Introduction
Het ontstaan en de progressie van cholangiopathieën zoals galatresie, primaire scleroserende cholangitis (PSC) en primaire gal cholangitis (PBC) zijn onbekend of onvolledig 1,2. Het beperkte begrip van de oorsprong en progressie van die ziekten leidt tot een gebrek aan therapiemogelijkheden3. Het moeilijkste obstakel bij het bestuderen van neonatale galwegaandoeningen is het verkrijgen van een moleculair begrip van de pathofysiologie. Een van de essentiële sleutels tot een beter begrip van moleculaire pathologie is de best mogelijke observatie van aangetast weefsel. Om verminderde vergelijkbaarheid en discrepanties tussen onderzoek te voorkomen, zoals het observeren van potentiële virale etiologie van galatresie4, ontstaat de behoefte aan de best mogelijke voorbereiding en het delen van de uitgevoerde dissectietechnieken. Een zuivere voorbereiding van het doelweefsel is noodzakelijk voor latere microscopische onderzoeken of het kweken van cel- en 3D-organoïde culturen. Bij muizennenatale aandoeningen zijn weefselmonsters echter zeldzaam en komen ze slechts in een kleine hoeveelheid voor vanwege de zeer kleine omvang. Met betrekking tot galwegaandoeningen zijn problemen beschreven bij een schone voorbereiding van galwegen bij muizenne neonaten5. Vanwege het neonatale stadium van ontwikkeling is weefseldifferentiatie niet overdreven geavanceerd, wat de voorbereiding bemoeilijkt en de moeilijkheid verhoogt in vergelijking met de voorbereiding van volwassen monsters. Daarom onderzocht de operationele werkgroep een nieuwe strategie voor het bereiden van de EBDS in een neonatale muismodel. In deze studie maakt de techniek een efficiënte verdeling van elk monster mogelijk.
Het galwegsysteem wordt intraperitoneaal in de rechter bovenbuik geplaatst, voortkomend uit de lever. De galblaas bevindt zich onder het viscerale oppervlak van de rechterkwab van de lever. Het galkanaal is samen met de poortader en de leverslagader ingebed in het hepatoduodenale ligament. Het verbindt de lever en de twaalfvingerige darm rechtstreeks en voert galvloeistof af naar de twaalfvingerige darm6. Anatomisch is het galkanaal verdeeld in de rechter- en linkerhepatische kanalen, het gemeenschappelijke leverkanaal, het cystische kanaal en het Ductus choledochus, dat wordt gevormd door de samenvloeiing van het cystische kanaal en het gemeenschappelijke leverkanaal7. Deze leegt uiteindelijk galvocht en speeksel uit het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm via de Ampulla van Vater.
Cholangiocyten bekleden het galkanaal intra- en extrahepatisch en wonen in een gecompliceerde anatomische niche waar ze helpen bij galproductie en homeostase8. Galvloeistof passeert deze gespecialiseerde epitheelcellen dagelijks in hoge concentraties. Met name het onderhoud van de HCO3-paraplu is erg belangrijk voor de bescherming tegen galzuurtoxiciteit9. Cholangiocyten zijn de eerste verdedigingslinie in het hepatobiliaire systeem tegen bijvoorbeeld luminale micro-organismen10. De afweereffectiviteit van de cholangiocyten tegen toxische aanvallen kan worden verzwakt door genetische aanleg. Een toxische overbelasting veroorzaakt schade en vernietiging en kan daarom leiden tot cholangiopathieën. Bovendien is het zich ontwikkelende galkanaal niet volledig in staat tot alle zelfbeschermende mechanismen, wat leidt tot een hogere gevoeligheid voor milieutoxines in neonatale galwegen11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel rapporteerde en besprak de creatie en validatie van een nieuwe chirurgische aanpak voor het verwijderen van de EBDS van geëuthanaseerde neonatale muizen. Microscopische en histologische bevindingen onthullen dat de aanpak snel EBD’s detecteert en ze ontleedt in de buurt van de marges van het kanaal, zelfs bij neonatale muizen. Alleen chirurgische instrumenten en een microscoop met een vergroting van 20x zijn vereist voor het beschreven protocol. Bovendien maakt de aanpak de isolatie van de gehele EBDS mogeli…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl en Magdalena Trochimiuk voor hun bijdragen. Hans Christian Schmidt werd financieel ondersteund door de Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
Referencias
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
