Lage dosis gammastralingssterilisatie voor gedecellulariseerde tracheale grafts
Summary
Het verkrijgen van sterilisatie is essentieel voor tracheale weefseltransplantatie. Hierin presenteren we een sterilisatieprotocol met behulp van lage dosis gammastraling die volledig wordt getolereerd door organen.
Abstract
Een van de belangrijkste aspecten om ervoor te zorgen dat een transplantatie correct evolueert, is de steriliteit van het medium. Gedecellulariseerde tracheale transplantatie omvat het implanteren van een orgaan dat oorspronkelijk in contact stond met de omgeving, waardoor het vanaf het begin niet steriel was. Hoewel het decellularisatieprotocol (door middel van detergentexpositie [2% natriumdodecylsulfaat], continu roeren en osmotische schokken) wordt uitgevoerd in overeenstemming met aseptische maatregelen, biedt het geen sterilisatie. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen het waarborgen van steriliteit voorafgaand aan in vivo implantatie. Hoewel er vastgestelde gammastralingssterilisatieprotocollen zijn voor anorganische materialen, zijn er geen dergelijke maatregelen voor organische materialen. Bovendien kunnen de bestaande protocollen voor anorganische materialen niet worden toegepast op organische materialen, omdat de vastgestelde stralingsdosis (25 kGy) het implantaat volledig zou vernietigen. Dit artikel bestudeert het effect van een geëscaleerde stralingsdosis in een gedecellulariseerde konijnenluchtpijp. We handhaafden het dosisbereik (kGy) en testten geëscaleerde doses totdat we de minimale dosis vonden waarbij sterilisatie wordt bereikt. Na het bepalen van de dosis bestudeerden we de effecten ervan op het orgaan, zowel histologisch als biomechanisch. We stelden vast dat hoewel 0,5 kGy geen steriliteit bereikte, doses van zowel 1 kGy als 2 kGy dat wel deden, waarbij 1 kGy daarom de minimale dosis was die nodig was om sterilisatie te bereiken. Microscopische studies toonden geen relevante veranderingen in vergelijking met niet-gesteriliseerde organen. Axiale biomechanische eigenschappen werden helemaal niet gewijzigd en er werd slechts een lichte vermindering van de kracht per lengte-eenheid waargenomen die het orgaan radiaal kan verdragen. We kunnen daarom concluderen dat 1 kGy volledige sterilisatie van gedecellulariseerde konijnenluchtpijp bereikt met een minimale of geen effecten op het orgaan.
Introduction
Sterilisatie van een implantaat is een basisvoorwaarde voor de levensvatbaarheid ervan; In feite zijn prothesen die succesvol zijn gebleken, die geïmplanteerd in steriele gebieden (bloedvaten, hart, bot, enz.) 1. De luchtpijp heeft twee oppervlakken: een oppervlak in contact met de externe omgeving, dat daarom niet steriel is, en een oppervlak naar het mediastinum, dat steriel is. Daarom is het vanaf het moment dat de luchtpijp wordt geëxtraheerd geen steriel orgaan. Ondanks dat het daaropvolgende decellularisatieproces wordt uitgevoerd in maximale steriele omstandigheden, is het geen sterilisatiestap2. De implantatie van vreemd materiaal op zich brengt een risico op infectie met zich mee vanwege de probacteriële micro-omgeving die het produceert3en een risico tot 0,014% op ziekteoverdracht van de donor naar de ontvanger, zelfs als het materiaal is gesteriliseerd4. Om een correcte vascularisatie van de luchtpijp te garanderen, ondergaat deze in bijna alle experimentele transplantatieprotocollen eerst heterotope implantaat 5,6,7 naar een steriel gebied (spier, fascia, omentum, subcutaan, enz.); Dit komt omdat het implanteren van een niet-steriel element in dit medium zou leiden tot infectie van het gebied3.
Er zijn verschillende mogelijke strategieën om een steriel implantaat te verkrijgen. Met behulp van superkritische CO2is terminale sterilisatie 8,9 bereikt. Andere methoden, zoals ultraviolette straling of behandeling met stoffen zoals perazijnzuur, ethanol, zuurstofperoxide en geëlektrolyseerd water, hebben verschillende succespercentages bij sterilisatie verkregen, bijna altijd afhankelijk van hun doseringen, maar er is aangetoond dat ze de biomechanische kenmerken van implantaten beïnvloeden. Inderdaad, sommige stoffen, zoals ethyleenoxide, kunnen de structuur van de geïmplanteerde matrix aanzienlijk veranderen en kunnen zelfs ongewenste immunogene effecten veroorzaken. Om deze reden kunnen veel van deze strategieën niet worden toegepast op biologische modellen 2,10,11,12,13.
De meest bestudeerde en geaccepteerde sterilisatiestrategie is die van de ISO 11737-1:2006-norm voor de sterilisatie van medische hulpmiddelen die bij mensen zijn geïmplanteerd, met een gammastralingsdosis van 25 kGy. Deze verordening richt zich echter alleen op de sterilisatie van inerte, niet-biologische elementen14,15. Bovendien zijn de doses radiotherapie bij de radicale behandeling van carcinoom drie ordes van grootte lager dan die welke worden gebruikt om medische hulpmiddelen te steriliseren1. Met dit in gedachten kunnen we concluderen dat deze dosis niet alleen de microbiota zou doden, maar ook de biologische structuur van het implantaat zou vernietigen en radicaal zou veranderen. Er is ook de mogelijkheid dat het bij afbraak resterende lipiden zou genereren, die mogelijk cytotoxisch kunnen zijn en de enzymatische afbraak van de steiger 13,14,15,16,17 kunnen versnellen, zelfs bij gebruik van doses zo laag als 1,9 kGy en met schade die recht evenredig is met de ontvangen stralingsdosis 17.
Het doel van dit artikel is dus om te proberen de stralingsdosis te identificeren die het mogelijk maakt om een steriel implantaat te verkrijgen met minimale schadelijke effecten veroorzaakt door bestraling 2,18,19. De strategie die we volgden omvatte de bestraling van gedecellulariseerde en bestraalde luchtpijpen bij verschillende geëscaleerde doses binnen een bereik van kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, enz.), totdat een negatieve cultuur werd bereikt. Aanvullende tests werden uitgevoerd voor die doses die negatieve culturen bereikten, om sterilisatie te bevestigen. Na het bepalen van de minimale dosis om sterilisatie te verkrijgen, werden de structurele en biomechanische effecten van de bestraling op de luchtpijp gecontroleerd. Alle statistieken werden vergeleken met de controle inheemse konijnen luchtpijpen. De sterilisatie van het construct werd vervolgens in vivo getest door de luchtpijpen in Nieuw-Zeelandse witte konijnen te implanteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er bestaan verschillende sterilisatiestrategieën. Superkritisch CO2dringt volledig door in weefsels, verzuurt het medium en deconstrueert de cellulaire fosfolipide dubbellaag met eenvoudige eliminatie door middel van drukverlaging van het implantaat 8,14,25. Ultraviolette straling is ook gebruikt en de effectiviteit ervan bij de luchtpijp van knaagdieren is gepubliceerd, hoewel er slechts een paar rapporten in de lit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit artikel werd ondersteund door de 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Nummer 180101 toegekend aan Néstor J.Martínez-Hernández] en PI16-01315 [toegekend aan Manuel Mata-Roig] door het Instituto de Salud Carlos III. CIBERER wordt gefinancierd door het VI National R&D&I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions en het Instituto de Salud Carlos III, met steun van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
Referencias
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
