Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a
Summary
Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.
Abstract
O aumento do uso de sequenciamento na medicina identificou milhões de variantes codificadoras no genoma humano. Muitas dessas variantes ocorrem em genes associados a distúrbios do neurodesenvolvimento, mas o significado funcional da grande maioria das variantes permanece desconhecido. O presente protocolo descreve o estudo de variantes para Ube3a, um gene que codifica uma ubiquitina ligase E3 ligada ao autismo e à síndrome de Angelman. A duplicação ou triplicação de Ube3a está fortemente ligada ao autismo, enquanto sua deleção causa a síndrome de Angelman. Assim, a compreensão da valência das alterações na atividade da proteína UBE3A é importante para os desfechos clínicos. Aqui, um método rápido, baseado em células, que emparelha variantes Ube3a com um repórter de via Wnt é descrito. Este ensaio simples é escalável e pode ser usado para determinar a valência e a magnitude das mudanças de atividade em qualquer variante do Ube3a . Além disso, a facilidade deste método permite a geração de uma riqueza de informações estrutura-função, que podem ser usadas para obter insights profundos sobre os mecanismos enzimáticos da UBE3A.
Introduction
Avanços tecnológicos recentes têm tornado rotineiro o sequenciamento de exomas e genomas em ambientes clínicos 1,2. Isso levou à descoberta de um grande número de variantes genéticas, incluindo milhões de variantes missense que normalmente mudam um aminoácido em uma proteína. Compreender o significado funcional dessas variantes continua sendo um desafio, e apenas uma pequena fração (~2%) das variantes de missense conhecidas tem uma interpretação clínica 1,3.
Um exemplo proeminente desse problema é o Ube3a, um gene que codifica uma ligase de ubiquitina E3 que tem como alvo proteínas de substrato para degradação4. Ube3a reside no cromossomo 15q11-13 e é expresso exclusivamente a partir do alelo herdado maternalmente 5,6,7. Observações da genética da doença sugerem fortemente que a atividade insuficiente ou excessiva da enzima UBE3A causa distúrbios distintos do neurodesenvolvimento. A deleção do cromossomo materno 15q11-13 causa síndrome de Angelman (EA)8, distúrbio caracterizado por deficiência intelectual grave, comprometimento motor, convulsões, comportamento feliz com sorriso frequente e características faciais dismórficas 8,9,10. Em contraste, a duplicação ou triplicação do cromossomo materno 15q11-13 causa a síndrome de Dup15q, uma condição heterogênea reconhecida como uma das formas sindrômicas mais prevalentes de autismo11,12,13. Além disso, existem centenas de variantes missense identificadas no Ube3a, a maioria das quais são consideradas variantes de significado incerto (USV), pois seu significado funcional e clínico são desconhecidos. Assim, há um interesse considerável no desenvolvimento de métodos que possam avaliar empiricamente as variantes do Ube3a para determinar se elas contribuem para a doença do neurodesenvolvimento.
A enzima UBE3A pertence à família de domínios HECT (homóloga ao E6-AP C-terminus) de ligases E3 ubiquitina que possuem o domínio homônimo HECT, que contém o maquinário bioquímico necessário para aceitar ubiquitina ativada de enzimas E2 e transferi-la para proteínas de substrato14. Historicamente, a caracterização das enzimas E3 tem se baseado em sistemas in vitro reconstituídos que requerem um conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tais métodos são lentos e trabalhosos e não são passíveis de avaliar a atividade de um grande número de variantes. Em trabalhos anteriores, o UBE3A foi identificado para ativar a via Wnt em células HEK293T, modulando a função do proteassoma para retardar a degradação da β-catenina17. Essa percepção permite o uso de repórteres de via Wnt como um método eficiente e rápido para identificar variantes de perda e ganho de função do Ube3a18. O protocolo abaixo descreve em detalhes um método para gerar variantes Ube3a, bem como um repórter baseado em luciferase para avaliar mudanças na atividade de variantes Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito fornece um método eficiente e escalável para avaliar a atividade enzimática das variantes de Ube3a. Existem vários detalhes técnicos que merecem uma consideração cuidadosa ao usar este ensaio. Uma consideração é a escolha dos plasmídeos repórteres Wnt utilizados neste ensaio. O protocolo descrito aqui usa especificamente o β-catenin activated reporter (BAR)21, um reportador que contém um concatenador de 12 elementos de resposta do fator de células …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), um NARSAD Young Investigator Award da Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), uma bolsa de pesquisa da Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), e bolsas de pesquisa da Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), da Whitehall Foundation (J.J.Y.) e do NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Referencias
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