長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル
Summary
このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ<250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。
Abstract
整列コラーゲンI(COL1)繊維は、腫瘍細胞の運動性を導き、内皮細胞の形態に影響を与え、幹細胞の分化を制御し、心臓および筋骨格組織の特徴です。 in vitroで整列した微小環境に対する細胞応答を研究するために、磁気的、機械的、細胞ベース、およびマイクロ流体法を含む、定義されたファイバー整列を有するCOL1マトリックスを生成するためのいくつかのプロトコルが開発されている。これらのうち、マイクロ流体アプローチは、流体の流れや細胞の微小環境を正確に制御するなどの高度な機能を提供します。しかし、高度な in vitro 培養プラットフォーム用に整列したCOL1マトリックスを生成するためのマイクロ流体アプローチは、500 μm未満の距離に伸びるCOL1繊維の薄い「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、3D細胞培養アプリケーションに役立ちません。ここでは、マイクロ流体デバイス内で定義されたファイバーアライメントのミリメートルスケール領域を持つ3D COL1マトリックス(厚さ130〜250 μm)を作製するためのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、細胞培養用のマイクロエンジニアリングマトリックスへの直接アクセスを提供することにより、構造化された組織の微小環境をモデル化するための高度な細胞培養機能を提供します。
Introduction
細胞は細胞外マトリックス(ECM)と呼ばれる複雑な3D線維ネットワークに存在し、その大部分は構造タンパク質コラーゲンI型(COL1)1,2で構成されています。ECMの生物物理学的特性は細胞にガイダンスの手がかりを提供し、それに応じて、細胞はECMマイクロアーキテクチャを再構築します3、4、5。これらの相互細胞-マトリックス相互作用は、腫瘍環境7,8,9における血管新生および細胞浸潤を促進し、細胞形態10,11,12、分極13、および分化14に影響を与える整列したCOL1ファイバードメイン6を生じ得る。整列したコラーゲン線維はまた、創傷治癒15を促進し、組織発達において重要な役割を果たし16、および長距離細胞コミュニケーションに寄与する17,18。したがって、ネイティブCOL1ファイバーマイクロアーキテクチャをin vitroで複製することは、整列した微小環境に対する細胞応答を研究するための構造化モデルの開発に向けた重要なステップです。
マイクロ流体細胞培養システムは、マイクロ生理学的システム(MPS)を開発するための好ましい技術として確立されています19,20,21,22,23。有利なマイクロスケールスケーリング効果を活用して、これらのシステムは流体の流れを正確に制御し、機械的力の制御された導入をサポートし、マイクロチャネル21、24、25、26、27内の生化学的微小環境を定義します。MPSプラットフォームは、組織特異的微小環境をモデル化し、多臓器相互作用を研究するために使用されています28。同時に、ヒドロゲルは、インビボで観察されるECMの3D力学および生物学的影響を再現するために広く探求されてきた29,30。 3D培養とマイクロ流体プラットフォームの統合にますます重点が置かれているため、多くのアプローチがマイクロ流体デバイス31、32、33でCOL1ヒドロゲルを組み合わせることができます。しかし、COL1ヒドロゲルをマイクロ流体チャネルに整列させる方法は、幅<1 mmのチャネルの薄い2D「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、整列した3D微小環境で細胞応答をモデル化する可能性は限られています31,34,35,36。
マイクロ流体システムにおいて整列した3D COL1ヒドロゲルを達成するために、自己組織化COL1溶液が局所的な伸長流(流れ方向に沿った速度変化)にさらされると、得られたCOL1ヒドロゲルは、それらが経験する伸長ひずみ速度の大きさに正比例する繊維配向の程度を示すことが示されている37。38。このプロトコルのマイクロチャネル設計は、2つの点で独特です。第1に、セグメント化された設計により、COL1ソリューションに局所的な伸張ひずみが導入され、第2に、その「ツーピース」構造により、ユーザーはCOL1ファイバーを整列させてからチャネルを分解して、整列したファイバーにオープンフォーマットで直接アクセスできます。このアプローチは、秩序あるCOL1マトリックスを持つ微小生理学的システムを開発するモジュラーマイクロ流体プラットフォームの開発にさらに採用できます。以下のプロトコルは、セグメント化されたマイクロチャネルを作製するプロセスについて説明し、ウシアテロCOL1を整列させるためのチャネルの使用を詳述しています。このプロトコルでは、オープンウェル形式でCOL1上の細胞を培養するための手順も提供し、モジュール式の磁気ベース層を使用してプラットフォームに機能を追加する方法について説明します。
Protocol
1. 2ピースチャンネルとモジュラープラットフォームベースの製作 注:マイクロ流体チャネルは、定義された厚さのポリジメチルシロキサン(PDMS)シートからかみそりでカットされたマイクロ流体チャネル「カットアウト」と、カットアウトに可逆的に結合してチャネルを形成するチャネルカバーの2つの部分で構成されています。チャネルは、媒体リザーバーと?…
Representative Results
自己組織化COL1溶液が断面積の減少を伴うチャネルを流れると、COL1溶液の流れ方向の速度(v x)は、2つのセグメント間のくびれの長さ(∂x)に沿って局所的に大きさ∂v x増加し、ε̇=∂v x/∂xの伸長ひずみ速度(ε̇)になります。伸張ひずみ速度は、図2に示すように、粒子画像速度測定(PIV)を使用して測定される流体速度から計算できます。 <p class="j…
Discussion
整列したファイバーでCOL1マトリックスを生成するためのプロトコルは、磁気的方法、機械的ひずみの直接適用、およびマイクロ流体技術を使用して説明されています47。マイクロ流体アプローチは、生化学的微小環境を正確に制御できる、明確に定義された流れと輸送特性により、マイクロ生理学的システムを作成するために一般的に使用されます。整列したCOL1ファイバー…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、国立衛生研究所(授与番号R21GM143658)および国立科学財団(助成金番号2150798)によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも資金提供機関の公式見解を表すものではありません。
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
Referencias
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Citar este artículo
Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).