양막에서 Lumican 추출 및 보관 온도 결정
Summary
본 프로토콜은 양막(AM)으로부터 루미칸을 추출하고 그의 단백질 및 루미칸 농도를 정량화하기 위해 -20°C, 4°C 및 실온(RT)에서 6, 12, 20 및 32일 동안 AM 추출물(AME)로서 그의 저장 조건을 설명한다.
Abstract
Lumican은 각막 상피화와 콜라겐 섬유 조직을 촉진하여 각막 투명성을 유지하는 인간 양막(AM)에 있는 작은 류신이 풍부한 프로테오글리칸입니다. 본 연구에서, AM으로부터 단백질을 추출하여 루미칸을 얻는 방법이 제안된다. 또한, 상이한 온도 및 시간대에 저장된 AM 추출물 (AME)에서 lumican의 안정성이 평가된다. 100mg의 AM을 해동하고 기계적 탈상피화하였다. 탈상피화된 AM을 동결시키고 미세 분말이 수득될 때까지 분쇄하고, 단백질 분해효소 억제제와 함께 2.5mL의 식염수 완충액으로 가용화하고, 단백질 추출을 위해 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, -20°C, 4°C, 및 실온(RT)에서 6, 12, 20, 및 32일 동안 저장하였다. 그 후, 루미칸을 각 AME에서 정량화하였다. 이 기술은 AM에서 lumican 추출을위한 접근 가능하고 획득 가능한 프로토콜을 허용합니다. 루미칸 농도는 보관 시간 및 온도 조건에 의해 영향을 받았다. -20°C 및 4°C에서 12일간 저장된 AME에서 루미칸은 다른 AME보다 유의하게 높았다. 이 lumican 추출은 치료 및 제약 솔루션 개발에 유용 할 수 있습니다. 재상피화 및 상처 치유 과정에서 AME lumican의 사용을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
Introduction
각막 애정에 가장 많이 사용되는 치료법 중 하나는 양막 이식입니다. 그러나 최근 몇 년 동안 양수의 다양한 구성 요소를 대체 및 보조 치료법으로 사용하기위한 새로운 제안이 등장했습니다. AM의 가장 많이 연구 된 성분 중에는 AM 추출물 (AME) 1,2,3,4,5,6,7에서 얻은 성분이 있습니다. AM은 항 혈관 신생 단백질, 인터루킨 (IL), 금속 단백 분해 효소 (TIMPs)의 조직 억제제, 호중구 세포 외 트랩을 억제하는 TSG-6에 의해 매개되는 항 염증 단백질, 성장 인자 : 표피 성장 인자 (EGF), 형질 전환 성장 인자 (TGF) (알파 및 베타), 각질 세포 성장 인자 (KGF), 간세포 성장 인자 (HGF) 및 콜라겐 원 섬유 생성을 조절하여 각막 투명성을 유지하는 루미 칸과 같은 여러 가용성 인자를 포함합니다1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican은 콜라겐 섬유를 조직하고 각막 투명성을 유지하는 역할을하는 각막 기질 기질의 간질 콜라게나제의 주요 세포 외 구성 요소 중 하나 인 작은 류신이 풍부한 프로테오글리칸 (SLRP)입니다 4,10,11. 프로테오글리칸은 세포 외 기질 (ECM)의 분자로, 세포 신호 전달을 수행하고 세포 내 항상성을 유지하는 주요 분자입니다12. ECM 단백질은상처 치유 동안 증식, 분화 및 이동의 세포 과정을 주도하는 것으로 보고되었습니다11.
증거는 각막 재 상피화 과정에서 lumican의 참여 가능성을 나타냅니다. Saika et al.은 한 연구에서 각막 손상 후 손상 후 처음 8 시간에서 최대 3 일 사이에 각막 각질 세포에서 lumican이 검출 될 수 있음을 보여주었습니다. 둘째 날과 셋째 날에 가장 높은 농도의 루미칸을 나타내는 이 프로테오글리칸은 이후 7일째에 검출되지 않습니다13. 이 데이터는 각막 재 상피화 과정의 활성화에 lumican의 참여를 시사합니다. 다른 한편으로, 다른 연구에서, lumican의 부재는 재 상피화를 지연시키는 것으로보고되었다; 흥미롭게도 Lumican을 추가하면 재상피화 과정 4,11,13이 가속화될 수 있습니다. 마찬가지로, 최근 연구에 따르면 lumican은 각막 윤부 섬유 아세포14의 염증 기능을 조절할 수 있으며, 이는 염증성, 항 섬유화 및 재 상피 화 반응의 조절제로서 lumican의 역할을 시사합니다. 유사하게, lumican은 Fas-FasL과 같은 신호 분자와 상호 작용하여 각막 반응을 조절할 수 있습니다. 또한, 녹아웃 Lum–/- 마우스 모델에서 루미칸의 부재는 루미칸 신호전달의 부족이 적절한 각막 복구를 방해한다는 것을 입증했다15.
주로이 방법은 AM에서 lumican을 추출하는 실현 가능하고 접근 가능한 방법을 입증하는 것을 목표로합니다. 이 유리한 lumican 추출 방법을 사용하면 유사한 농도의 단백질을 얻을 수있어 처리 시간이 단축되고 이전 연구에 비해 조사자에게 더 편리합니다16. 또한, 이 AME 루미칸은 각막 복구 및 재상피화 과정을 위한 보조제로 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 AME에서 lumican의 존재와 다양한 저장 조건에서의 안정성과의 직접적인 상관 관계를 분석했습니다. 흥미롭게도 AME의 총 단백질 농도를 정량화하면 보관 후 단백질 농도가 증가했습니다. 증거는 냉동 보관에서 단백질 농도를 변화시킬 수 있는 세 가지 메커니즘, 즉 저온 변성, 용질의 동결 농도 및 얼음으로 인한 단백질 구조의 부분 풀림을 시사합니다19. 냉동 과정은…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
Referencias
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