Live-Cell-Bildgebung intakter Ex-vivo-Globen mit einem neuartigen 3D-gedruckten Halter
Summary
Die vorliegende Arbeit beschreibt ein neuartiges experimentelles Protokoll, das einen 3D-gedruckten Halter verwendet, um hochauflösende Lebendzellbildgebung von enukleierten Globen zu ermöglichen. Durch dieses Protokoll kann die zelluläre Kalziumsignalaktivität in verwundetem Hornhautepithel von ex vivo Globen in Echtzeit beobachtet werden.
Abstract
Die Hornhautepithelwundheilung ist ein Migrationsprozess, der durch die Aktivierung purinerger Rezeptoren initiiert wird, die auf Epithelzellen exprimiert werden. Diese Aktivierung führt zu Kalziummobilisierungsereignissen, die sich von Zelle zu Zelle ausbreiten, die für die Initiierung der Zellmotilität in das Wundbett unerlässlich sind und eine effiziente Wundheilung fördern. Das Trinkaus-Randall-Labor hat eine Methodik entwickelt, um die Hornhautwundheilungsreaktion in ex vivo Mauskugeln in Echtzeit abzubilden. Dieser Ansatz beinhaltet die Enukleierung eines intakten Globus aus einer Maus, die gemäß etablierten Protokollen eingeschläfert wurde, und die sofortige Inkubation des Globus mit einem Kalziumindikatorfarbstoff. Ein Gegenfleck, der andere Merkmale der Zelle färbt, kann in diesem Stadium angewendet werden, um die Bildgebung zu unterstützen und zelluläre Orientierungspunkte zu zeigen. Das Protokoll funktionierte gut mit mehreren verschiedenen lebenden Zellfarbstoffen, die für die Gegenfärbung verwendet wurden, einschließlich SiR-Aktin zur Färbung von Aktin und tiefroter Plasmamembranfärbung zur Färbung der Zellmembran. Um die Reaktion auf eine Wunde zu untersuchen, wird das Hornhautepithel mit einer 25-G-Nadel verletzt und die Kugeln in einen 3D-gedruckten Halter gelegt. Die Abmessungen des 3D-gedruckten Halters sind kalibriert, um die Immobilisierung des Globus während der gesamten Dauer des Experiments zu gewährleisten, und können modifiziert werden, um Augen unterschiedlicher Größe aufzunehmen. Die Live-Zellbildgebung der Wundantwort wird kontinuierlich in verschiedenen Tiefen des Gewebes im Laufe der Zeit mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, hochauflösende Bilder in Publikationsqualität mit einem 20-fachen Luftobjektiv auf einem konfokalen Mikroskop zu erzeugen. Für dieses Protokoll können auch andere Ziele verwendet werden. Es stellt eine signifikante Verbesserung der Qualität der Lebendzellbildgebung in ex vivo Mauskugeln dar und ermöglicht die Identifizierung von Nerven und Epithel.
Introduction
Hornhaut
Die Hornhaut ist eine klare, avaskuläre Struktur, die die vordere Oberfläche des Auges bedeckt, Licht bricht, um das Sehen zu ermöglichen und das Innere des Auges vor Schäden zu schützen. Da die Hornhaut der Umwelt ausgesetzt ist, ist sie anfällig für Schäden sowohl durch mechanische Ursachen (Kratzen) als auch durch Infektionen. Eine Hornhautverletzung bei einem ansonsten gesunden Patienten heilt typischerweise innerhalb von 1-3 Tagen. Bei Patienten mit Grunderkrankungen wie limbalem Stammzellmangel und Typ-II-Diabetes kann der Hornhautwundheilungsprozess jedoch stark verlängert werden1. Da die Hornhaut stark innerviert ist, sind diese nicht heilenden Hornhautgeschwüre und wiederkehrenden Hornhauterosionen sehr schmerzhaft und verringern die Lebensqualität der Patienten, die sie erleben, stark1.
Zellsignalisierung
Wenn eine ansonsten gesunde Hornhaut verletzt wird, gehen Kalziumsignalereignisse in den an die Wunde angrenzenden Zellen vor und veranlassen eine zelluläre Migration in das Wundbett, wo sie die Verletzung ohne das Risiko einer Narbenbildung schließen 2,3. Diese Signalereignisse wurden in Hornhautepithelzellkulturmodellen mit Lebendzellbildgebung gut charakterisiert2. Vorläufige Experimente zeigen signifikant mehr Kalziumsignale nach Verletzungen in nicht-diabetischen Zellen im Vergleich zu diabetischen Zellen. Die Charakterisierung der Zellsignalereignisse in ex vivo Globen hat sich jedoch als technische Herausforderung erwiesen.
Bildgebung lebender Zellen
Frühere Studien haben erfolgreich Kalziumsignalereignisse aus in vitro Zellkulturmodellen der Hornhautwundheilung aufgezeichnet 4,5,6. Die Entwicklung einer Methodik zur Erzeugung qualitativ hochwertiger Bilder dieser Signalereignisse in ex vivo Gewebe ist von großem Interesse, da sie die Untersuchung dieser Ereignisse in einem komplexeren und lebensechten System ermöglichen würde. Frühere Ansätze beinhalteten die Dissektion der Hornhaut gefolgt von einer Immobilisierung in einem UV-induzierten PEG-Gel 7,8,9. Die Immobilisierung ist ein wesentlicher, aber auch herausfordernder Schritt bei der Arbeit mit lebendem Gewebe, da es während des gesamten Experiments lebensfähig und hydratisiert bleiben muss. Außerdem darf die Ruhigstellung das Gewebe nicht schädigen. Während die PEG-Lösung das Gewebe immobilisierte, waren Auflösung und Qualität der erzeugten Bilder nicht konsistent. Daher wurden 3D-gedruckte Halter entwickelt, um intakte Kugeln zu immobilisieren, um qualitativ hochwertigere Bilder mit geringerem Risiko von Gewebeschäden zu erzeugen.
Der Ansatz
Ein einzigartiger 3D-gedruckter Halter wurde entwickelt, um intakte Ex-vivo-Globen für die Bildgebung lebender Zellen zu immobilisieren. Dieser Halter verhindert Schäden durch zwei Hauptquellen: Er ermöglicht die Abbildung eines enukleierten Globus, ohne dass die Hornhaut seziert werden muss, und er eliminiert die Exposition gegenüber UV-Licht. Ohne diese Schadensquellen stellten die erhaltenen Bilder die Reaktion auf die experimentell durchgeführten Kratzverletzungen genauer dar. Darüber hinaus wurde der 3D-gedruckte Halter auf die genauen Abmessungen des Mausauges kalibriert. Dies führte zu einer viel besseren Passform als die Immobilisierung in PEG-Lösung, was aufgrund der verminderten Gewebebewegung zu einem qualitativ hochwertigeren Bild bei Zielen mit geringerer Leistung führte. Eine an der Oberseite des Halters angebrachte Abdeckstange stellt sicher, dass der Globus während der gesamten Dauer des Experiments unbeweglich bleibt und dass es keine Verschiebung des Globus gibt, wenn Wachstumsmedien aufgetragen werden, um die Hydratation und Lebensfähigkeit zu erhalten. Die Möglichkeit, den Halter auf genaue Abmessungen zu drucken, ermöglicht es uns auch, eine optimale Passform für Mausaugen unterschiedlicher Größe aufgrund des Alters oder des Krankheitsstatus zu generieren. Diese Technologie kann breiter angewendet werden, um Halter für die Augen verschiedener Arten basierend auf ihren Abmessungen zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Lebendzellbildgebungstechnik, die einen 3D-gedruckten Halter verwendet, um intakte Tieraugen zu stabilisieren und zu immobilisieren. Es wurde entwickelt, um mehrere signifikante Nachteile zu umgehen, die mit früheren Live-Zellbildgebungsprotokollen von Ex-vivo-Hornhautgewebe erkannt wurden. Dieses Protokoll bietet viele Vorteile für die Lebendzellbildgebung intakter Kugeln. Es reduziert signifikant unnötige Gewebeschäden, die die Wundheilungsreaktion auf experimentell induzie…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem NIH für die folgende Zuschussunterstützung: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) und 5T32GM008541-24 (KS). Wir möchten auch den Massachusetts Lions Eye Research Fund und den New England Corneal Transplant Fund würdigen.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
Referencias
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioingeniería. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
