Выделение пластоглобулы липидных капель из ткани листьев растений и цианобактерий
Summary
Представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобулы липидных капель, связанных с различными фотосинтезирующими организмами. Успешное получение изолированных пластоглобул является важным первым шагом, который предшествует подробным молекулярным исследованиям, таким как протеомный и липидомический анализы.
Abstract
Капли липидов пластоглобул являются динамическим субкомпоном растительных хлоропластов и цианобактерий. Считается, что они повсеместно встречаются среди фотосинтезирующих видов и играют центральную роль в адаптации и ремоделировании тилакоидной мембраны в быстро меняющихся условиях окружающей среды. Способность выделять пластоглобулы высокой чистоты значительно облегчила их изучение с помощью протеомных, липидомных и других методологий. С пластоглобулами высокой чистоты и выхода можно исследовать их липидный и белковый состав, ферментативную активность и топологию белка, среди других возможных молекулярных характеристик. В данной статье представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобул из хлоропластов ткани листьев растений и представлены методологические вариации выделения пластоглобул и связанных с ними липидных капельных структур из листьев кукурузы, высохшей листовой ткани воскрешающего растения Eragrostis nindensis и цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Изоляция зависит от низкой плотности этих богатых липидами частиц, что облегчает их очистку флотации плотности сахарозы. Эта методология окажется полезной при изучении пластоглобул различных видов.
Introduction
Современное понимание состава и функции пластоглобул появилось благодаря подробным протеомным и липидомическим исследованиям 1,2,3,4,5. Таким исследованиям в значительной степени способствовал быстрый и эффективный метод изоляции, который опирается на их очень низкую плотность для эффективного разделения с использованием градиентов сахарозы. Первоначальные методы выделения пластоглобул были достигнуты из таких видов, как буковое дерево (Fagus sylvatica), шотландский веник (Sarothamnus scoparius), лук (Allium cepa), шпинат (Spinacia oleracea), анютины глазки (Viola tricolor), перец (Capsicum annuum) и горох (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Обновленный метод выделения хлоропластобул более эффективным и лучшим способом получения урожая был позднее представлен Ytterberg et al.3,14. Хотя первоначально мы использовались для изучения пластоглобул хлоропластов листьев Arabidopsis thaliana, мы успешно использовали этот обновленный метод для здоровой листовой ткани других видов растений, как монокота, так и дикота, включая кукурузу (Zea mays), помидор (Solanum lycopersicum), лавграсс (Eragrostis nindensis), фиолетовый ложный бром (Brachypodium distachyon) и дикий табак (Nicotiana benthamiana). ; неопубликованные результаты). Кроме того, метод выделения был успешно адаптирован к пластоглобулам цианобактерий, включая Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena sp. PCC 712015, а также к высохшей листовой ткани воскрешающего растения E. nindensis.
Хлоропластовые пластоглобулы здоровой ткани листа физически соединены с тилакоидными мембранами16. Несмотря на эту физическую непрерывность, два субкомпамента хлоропластов сохраняют различные липидные и белковые композиции, хотя регулируемый обмен липидами и белками между двумя компартментами был предложен 2,4,17,18,19. На самом деле, недавно была предложена интересная модель гемифузии для обмена нейтральными липидами между хлоропластами и цитозолом19. Из-за физической непрерывности пластоглобул и тилакоидов метод выделения со здоровой тканью листьев начинается со сбора гранулированного сырого тилакоидного препарата, который впоследствии обрабатывают ультразвуком для отделения пластоглобул от тилакоидов, что в отличие от методов, используемых для выделения цитозольных липидных капель20 . Ультрацентрифугирование на сахарозной подушке затем запускает пластоглобулы низкой плотности вверх через сахарозу, эффективно отделяя их от тилакоидов, ядер и другого материала высокой плотности. Напротив, пластоглобулы в цианобактериях, а также в высохшей ткани листа, очевидно, существуют in vivo в свободно плавающей форме. Следовательно, их изоляция включает в себя непосредственное плавание на градиенте сахарозы. Эта статья демонстрирует метод выделения из здоровой листовой ткани и дополнительно демонстрирует две вариации, которые могут быть использованы для выделения пластоглобул из высохшей листовой ткани или цианобактериальных культур, значительно расширяя физиологическую широту и эволюционный контекст, в котором пластоглобулы могут быть изучены.
Изолированные пластоглобулы могут впоследствии использоваться для любого количества последующих анализов для исследования молекулярных характеристик. Мы использовали выделенные пластоглобулы из ткани листьев A. thaliana для обширного протеомного и липидомического анализа в различных условиях окружающей среды или генотипах, демонстрируя селективную модификацию белкового и липидного состава при адаптации к стрессу 2,4,21,22. Кроме того, были проведены анализы киназы in vitro, которые демонстрируют активность трансфосфорилирования, связанную с изолированными пластоглобулами, 22, олигомерные состояния белковых компонентов были исследованы с использованием нативного гелевого электрофореза 21 и протеазно-бритвенные анализы были выполнены23.
Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры. По нашему опыту, протоколы, описанные ниже, могут быть полностью завершены в течение примерно 4 часов. Описан альтернативный способ выделения пластоглобул из листовой ткани, который позволяет одновременно выделять другие подкомпоны24 хлоропласта. Этот альтернативный метод дает некоторые явные преимущества, когда количественное сравнение с другими подотсеками хлоропласта необходимо или желательно. Однако этот альтернативный метод также более утомителен и обеспечит значительно более низкий выход изолированных пластоглобул из сопоставимых количеств листовой ткани. Когда целью является целенаправленное изучение пластоглобул, методология, изложенная здесь, является оптимальным выбором. Тем не менее, общее количество листовых и сырых тилакоидных аликвот может быть собрано во время подготовки образца, и настоятельно рекомендуется сделать это, чтобы иметь эталонные образцы для последующего сравнения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы свести к минимуму физиологические/биохимические изменения материала и защитить определенные фото- и термолабильные прениллипидные пигменты, которые являются богатым компонентом пластоглобул, крайне важно выполнить изоляцию при 4 °C и защитить от света. Как указано выше, начальн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лабораторной группе Лундквиста поддерживаются грантами NSF (MCB-2034631) и USDA (MICL08607) P.K.L. Авторы благодарят доктора Кэрри Хизер (МГУ) за поддержку в разработке метода выделения цианобактериальных пластоглобул.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
Referencias
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
