Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel

Summary

Il presente studio descrive le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la lavorazione, la colorazione, l’etichettatura e l’esame di interi sferoidi e organoidi sotto vari microscopi, mentre rimangono intatti in un idrogel all’interno di un dispositivo multiuso.

Abstract

Gli organoidi e gli sferoidi, strutture di crescita tridimensionale nei laboratori di coltura cellulare, stanno diventando sempre più riconosciuti come modelli superiori rispetto ai modelli di coltura bidimensionale, poiché imitano meglio il corpo umano e hanno vantaggi rispetto agli studi sugli animali. Tuttavia, questi studi affrontano comunemente problemi di riproducibilità e coerenza. Durante i lunghi processi sperimentali – con trasferimenti di organoidi e sferoidi tra diversi vasi di coltura cellulare, pipettaggio e centrifugazione – queste strutture di crescita 3D sensibili e fragili sono spesso danneggiate o perse. In definitiva, i risultati sono significativamente influenzati, poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. I metodi qui descritti riducono al minimo questi passaggi stressanti e garantiscono un ambiente sicuro e coerente per organoidi e sferoidi durante tutta la sequenza di lavorazione mentre sono ancora in un idrogel in un dispositivo multiuso. I ricercatori possono crescere, congelare, scongelare, elaborare, colorare, etichettare e quindi esaminare la struttura di organoidi o sferoidi sotto vari strumenti ad alta tecnologia, dai microscopi confocali a quelli elettronici, utilizzando un unico dispositivo multiuso. Questa tecnologia migliora la riproducibilità, l’affidabilità e la validità degli studi, pur mantenendo un ambiente stabile e protettivo per le strutture in crescita 3D durante la lavorazione. Inoltre, l’eliminazione dei passaggi stressanti riduce al minimo gli errori di gestione, riduce il tempo impiegato e diminuisce il rischio di contaminazione.

Introduction

Il futuro della ricerca e della terapia cellulare risiede nelle colture cellulari 3D ^1,2,3. I modelli organoidi e sferoidi colmano il divario tra esperimenti in vitro e modelli animali creando modelli migliori che imitano lo sviluppo, la fisiologia e le malattie del corpo umano 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la riproducibilità e la ripetibilità di questi modelli rimangono impegnative. Inoltre, la manipolazione, la raccolta, il trasferimento e la centrifugazione di queste strutture con le tecnologie attuali provocano la perdita o il danneggiamento degli organoidi e degli sferoidi in molte condizioni, influenzando significativamente i risultati.

Nonostante molti protocolli per la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l’etichettatura con immunofluorescenza e la crioconservazione, non esiste un approccio universale relativo alla standardizzazione delle condizioni sperimentali, alla gestione e all’elaborazione di queste delicate strutture senza perderle o danneggiarle. I protocolli attuali sono anche incredibilmente lunghi, alternati da pochi giorni a diverse settimane, e includono procedure complesse con vari reagenti 10,11,12,13,14. Inoltre, la raccolta, il pipettaggio, la centrifugazione e il trasferimento di strutture di crescita 3D tra vasi di coltura cellulare e crioviali causano cambiamenti nel posizionamento delle strutture e delle forze meccaniche e, in ultima analisi, influenzano la differenziazione e la maturazione degli organoidi e degli sferoidi. È stato riportato che la topologia tissutale, il posizionamento delle cellule e le forze meccaniche influenzano significativamente la differenziazione e la maturazione cellulare 6,15,16,17.

Pertanto, è auspicabile migliorare le attuali tecnologie convenzionali per generare organoidi e sferoidi con qualità stabile. Un metodo/dispositivo che salterà la centrifugazione e le altre fasi sopra descritte e fornirà il materiale in un unico ambiente sicuro dall’inizio alla fine dei molteplici processi sarebbe utile per raggiungere i dati più coerenti e affidabili. Inoltre, ciò ridurrà i vincoli di tempo, manodopera e costi.

Il dispositivo multiuso (MD) qui descritto fornisce un unico ambiente sicuro per più processi di organoidi e sferoidi (Figura supplementare 1). Questo dispositivo e i protocolli complementari eliminano le fasi di raccolta, pipettaggio, trasferimento e centrifugazione. Gli organoidi e gli sferoidi rimangono nel loro ambiente in vitro durante i processi sequenziali. Questo ambiente comprende principalmente componenti della matrice extracellulare naturale o sintetica, come gli idrogel disponibili in commercio. In altre parole, i metodi qui descritti consentono di elaborare, esaminare e congelare un campione intero di organoidi / sferoidi mentre è ancora in una goccia di idrogel.

Il dispositivo biocompatibile è resistente a temperature comprese tra 60 °C e -160 °C, il che rende possibile ripristinare gli organoidi/steroidi in un serbatoio di azoto liquido a -160 °C o preparare blocchi di resina per microscopia elettronica a 60 °C. La nicchia nel dispositivo è stata progettata per definire uno spazio limitato per le strutture di crescita 3D e stimolare la formazione di sferoidi o organoidi sulla base degli studi precedenti 18,19,20,21,22,23. Quella parte del dispositivo è trasparente e contiene una plastica specifica che fornisce un’elevata qualità ottica (indice di rifrazione: 1,43; valore di abbe: 58; spessore: 7,8 mil [0,0078 in o 198 μm]). Sia la nicchia che la parte “laterale” circostante causano l’autofluorescenza. La nicchia trasparente al centro ha un’area di 80 mm 2, mentre la parte laterale è di 600 mm². La profondità del contenitore è di 15 mm e lo spessore è di 1,5 mm. Queste caratteristiche, oltre alle dimensioni e al design del dispositivo, consentono di effettuare osservazioni con diversi tipi di microscopio ad alta tecnologia e preparare i campioni per gli esami al microscopio elettronico (Figura 2). Il sistema di chiusura del dispositivo prevede due posizioni, una sigillata nel congelatore e l’altra che consente il flusso di gas nell’incubatore. I saggi di proliferazione e citotossicità di CCK8 dimostrano effetti simili sulle cellule rispetto ai tradizionali piatti di coltura cellulare (Figura supplementare 2). Il test di esclusione del blu di Trypan dimostra un’elevata vitalità cellulare (94%) durante la coltura cellulare nel MD (Figura 3).

I processi che possono essere eseguiti per un campione nel singolo dispositivo comprendono (1) coltura, (2) colorazione istologica, (3) immunocolorazione, compresa la marcatura immunoistochimica e immunofluorescenza, (4) congelamento, (5) scongelamento, (6) esame al microscopio ottico, come microscopi a campo chiaro, campo scuro, fluorescenza, confocale e super-risoluzione, (7) rivestimento ed esame direttamente al microscopio elettronico a scansione o (8) preparazione per la microscopia elettronica a trasmissione ( Figura 2).

Esistono diverse metodologie per la colorazione istologica, la marcatura immunoistochimica o la marcatura fluorescente di organoidi e sferoidi 10,11,12,13,14,24,25. La loro raccolta dall’idrogel è il primo e principale passo della tecnologia attuale. Dopo questo passaggio, alcuni metodi consentono l’immuno-marcatura a montaggio intero. Gli organoidi raccolti sono incorporati in paraffina, sezionati ed etichettati per la colorazione e l’immunocolorazione in altri. Tuttavia, le sezioni potrebbero non presentare l’intero campione e fornire solo dati limitati relativi all’architettura 3D della struttura. Inoltre, il danneggiamento di queste strutture 3D e la perdita di antigenicità sono effetti collaterali ben noti di queste tecnologie.

I nuovi protocolli complementari per gli esami microscopici in questo articolo consentono un’analisi di campioni interi ancora in un idrogel. I protocolli qui descritti includono due formulazioni di nuova concezione: soluzione per immunoistochimica (S-IHC) e soluzione per l’etichettatura immunofluorescenza (S-IF). I metodi con queste soluzioni consentono ai ricercatori di ottenere dati più accurati, poiché non ci sono effetti dannosi dei flussi di lavoro tradizionali, come centrifugazione, pipettaggio e trasferimento delle strutture delicate. Il protocollo qui descritto elimina anche la necessità di fasi di raccolta, blocco, pulizia e recupero dell’antigene e riduce l’intera procedura a 6-8 ore. Inoltre, la metodologia consente di aggiungere simultaneamente da uno a tre anticorpi allo stesso S-IF. Pertanto, è possibile ottenere i risultati nello stesso giorno anche dopo gli esperimenti di etichettatura multipla, che è un altro vantaggio del protocollo qui descritto; I tradizionali protocolli di etichettatura con immunofluorescenza a montaggio intero richiedono in genere da 3 giorni a diverse settimane 10,11,12,13,14.

Anche l’incorporazione di paraffina, un altro passaggio dannoso che riduce l’antigenicità, viene omesso. La struttura 3D rimane nel suo ambiente in vitro dall’inizio alla fine dell’esame microscopico. Poiché la struttura 3D rimane nelle sue condizioni di crescita, l’espressione proteica e i dati di localizzazione imitano meglio le condizioni in vivo . Sono attesi risultati più accurati, poiché la metodologia elimina i passaggi che influenzano l’espressione dell’antigene del campione. Le Tabelle 1 e 2 dimostrano come questi nuovi protocolli eliminino i passaggi, risparmino tempo e manodopera in laboratorio e riducano i costi e i prodotti di scarto rispetto ai flussi di lavoro tradizionali.

Oltre ai passaggi cruciali sopra descritti, un altro problema è fornire un mezzo di crioconservazione e un metodo per preservare la struttura 3D del campione con tassi di vitalità cellulare più elevati 26,27,28,29,30,31. La crioconservazione è essenziale per creare un sistema modello stabile e consentire la biobanca di organoidi e sferoidi^32,33. Il biobanking dell’intera struttura 3D originale consentirà una ricapitolazione più fedele dello stato naturale di salute o malattia. Le considerazioni chiave sono la convenienza e l’affidabilità della crioconservazione e lo scongelamento di organoidi/sferoidi. Il recupero degli organoidi post-disgelo è molto basso nella maggior parte delle tecnologie attuali, spesso inferiore al 50%. Tuttavia, studi recenti hanno mostrato risultati promettenti con tassi di sopravvivenza migliorati^26,27,28,29. Lee et al. hanno dimostrato che il 78% delle cellule sferoidi è sopravvissuto dopo la crioconservazione quando hanno usato la soluzione dell’Università del Wisconsin contenente il 15% di DMSO²⁸. Il rapporto di sopravvivenza cellulare è aumentato all’83% nello studio di Arai et ^al.29. Tuttavia, i risultati dopo la crioconservazione sono significativamente influenzati poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. Inoltre, sono necessari reagenti privi di siero per le buone pratiche di fabbricazione in ambito farmaceutico e diagnostico. I flussi di lavoro tradizionali utilizzano un terreno contenente siero bovino fetale (FBS) e dimetilsolfossido (DMSO) per il metodo di congelamento lento, entrambi associati a svantaggi. FBS è un prodotto di derivazione animale e può avere variazioni di lotto. Il DMSO è un crioprotettore di grande successo, ma l’esposizione a lungo termine, specialmente durante lo scongelamento, potrebbe causare effetti citotossici^30,31.

Questo articolo descrive anche la metodologia di congelamento / scongelamento di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel. Nello studio vengono utilizzate due formule per il congelamento di organoidi e sferoidi: (1) 10% di DMSO contenente una soluzione di congelamento tradizionale (FS) e (2) un mezzo di crioconservazione privo di siero e DMSO. Questo mezzo di crioconservazione contiene componenti della matrice extracellulare, che sono diversi dalle formule attuali. La matrice extracellulare comprende due classi principali di macromolecole, proteoglicani e proteine fibrose, che sono essenziali per l’impalcatura fisica dei costituenti cellulari, ma avviano anche i processi necessari per la morfogenesi dei tessuti, la differenziazione e l’omeostasi 34,35,36,37,38,39,40 . I collageni forniscono resistenza alla trazione, regolano l’adesione cellulare, supportano la chemiotassi e la migrazione e dirigono lo sviluppo dei tessuti³⁷. Inoltre, le fibre di elastina forniscono rinculo ai tessuti che subiscono ripetuti allungamenti³⁸. Una terza proteina fibrosa, la fibronectina, dirige l’organizzazione della matrice extracellulare interstiziale e ha un ruolo cruciale nel mediare l’attaccamento cellulare e funziona come meccano-regolatore extracellulare³⁹. Du et al. hanno dimostrato l’effetto crioprotettivo dell’idrolizzato di collagene di pollo sul sistema modello naturale di actomiosina⁴¹. I loro risultati suggeriscono che l’idrolizzato di collagene può inibire la crescita dei cristalli di ghiaccio, ridurre la denaturazione e l’ossidazione delle proteine in modo simile ai crioprotettori commerciali e fornire una migliore struttura del gel dopo i cicli di congelamento-scongelamento. Pertanto, l’aggiunta di componenti della matrice extracellulare ai mezzi di crioconservazione fornisce un ambiente più sicuro e protettivo per il campione e supporta le strutture viventi per guarire dopo il congelamento-scongelamento.

Inoltre, il presente studio descrive un protocollo semplice per etichettare le membrane citoplasmatiche e i nuclei di organoidi e sferoidi vivi mentre sono ancora nell’idrogel.

Protocol

1. Coltura di organoidi e sferoidi Mettere l’idrogel sul ghiaccio durante la notte (in frigorifero o in una cella frigorifera) per scongelare. Posizionare il dispositivo multiuso disponibile in commercio (MD; vedi Tabella dei materiali) nell’incubatore 1 giorno prima dell’esperimento (37 °C, 5% CO2) per riscaldare. Introdurre le punte sterili delle pipette a punta larga in frigorifero a 4 °C.NOTA: i passaggi 1.1-1.3 devono essere eseguiti il…

Representative Results

Il presente articolo rappresenta un dispositivo multiuso (MD) e integra le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l’etichettatura con immunofluorescenza, il rivestimento e la lavorazione di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel in un unico ambiente dal design univoco. L’attuale studio è stato progettato per preparare sferoidi per il cancro del fegato HepG2 in 35 gocce di idrogel in 35 MD. Gli esperimenti sono…

Discussion

L’MD, integrando le formulazioni e i protocolli qui descritti, facilita la crescita 3D rapida e spontanea di organoidi e sferoidi in un ambiente più controllato e continua l’esperimento nelle stesse condizioni. Il campione rimane nello stesso ambiente durante l’intero processo e quasi il 100% delle architetture di crescita 3D rimangono intatte nel contenitore. Ciò migliora l’omogeneità durante gli esperimenti sequenziali e consente un periodo di coltura prolungato. Inoltre, il numero di passaggi durante la lavorazione…

Materials

Absolute Ethanol (EtOH)	Merck	8187602500	Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone	Merck	8222512500	Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody	Biocare Medical	CP 028 A	Store at +4 °C
Anti-albumin antibody	Abcam	EPR20195	Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal	Abcam	134435	Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5	Abcam	53121	Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody	Biocare Medical	ACI 3058 A, B	Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-500G	Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)	Abcam	ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL	Nest	601051
Centrifuge tubes, 50 mL	Nest	602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 Incubator	Panasonic	KM-CC17RU2
Copper Grids	Electron Microscopy Sciences	G100-Cu	Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer	Leica	EM CPD300	For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture	Sigma Aldrich	AEC101	Store at +4 °C
Diamond knife	Diatome	Ultra 45°, 40-US	Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology	Biofroxx	67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes	Nest
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	41966-029	Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic	Bright Slide	2.BS01-105-1000
Epon resin	Sigma	45359-1EA-F	Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier	Pan Biotech	P30-3304	Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)	Cellorama	CellO-F	Store at +4 °C
Glass knife maker	Leica	EM KMR3	For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)	Leica	7890-08	Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%	Electron Microscopy Sciences	16210	Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution	Sigma Aldrich	56-81-5	Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647	Invitrogen	A32933	Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488	Invitrogen	35502	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550	Invitrogen	84540	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488	Invitrogen	35552	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550	Invitrogen	84541	Store at +4 °C
Hematoxylin Harris	Bright Slide	2.BS01-104-1000
HepG2 cells	ATCC	HB-8065	Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6	R&D Systems	MAB2020	Store at -20 °C
Hydrogel	Corning	354248	Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel	Corning	354234	Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel	ThermoFischer Scientific	A1413201	Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel	Biotechne, R&D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative			%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid	Sigma	11189-100G	Store at RT
Lead aspartate solution			Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate	Electron Microscopy Sciences	17900	Store at RT
Leica Confocal Microscope	Leica	DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss
Microplate reader	Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD)	Cellorama	CellO-M
Nuclear-DNA stain	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain	ThermoFischer Scientific	62248	DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%	Electron Microscopy Sciences	19190	Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody	R&D systems	MAB2020	Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%	Sigma	1.04005.1000	Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets	MP Biomedicals, LLC	2810305
Post-fixative solution			%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%	Electron Microscopy Sciences	26603-01	Store at RT
Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS	Zeiss	Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL	Nest	620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment	Zeiss	GeminiSEM 500	We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack	ScyTek Laboratories	SHP125	Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2	Electron Microscopy Sciences	11655	Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)	Cellorama	CellO-IF	Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)	Cellorama	CellO-P	Store at +4 °C
Specimen trimming device	Leica	EM TRIM2	For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater	Leica	EM ACE200	Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma	223220-5G	Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Ultra gel super glue	Pattex	PSG2C	For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL	Nest	171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL	Isolab	L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL	Nest	110919HA01
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT