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Biología

Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição in vivo por transferência de energia de ressonância de fluorescência

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é uma técnica de imagem para detectar interações proteicas em células vivas. Aqui, um protocolo FRET é apresentado para estudar a associação de enzimas modificadoras de histona com fatores de transcrição que as recrutam para os promotores alvo da regulação epigenética da expressão gênica em tecidos vegetais.

Abstract

A regulação epigenética da expressão gênica é comumente afetada por enzimas modificadoras de histonas (HMEs) que geram marcas de histonas heterocromáticas ou eucromáticas para repressão ou ativação transcricional, respectivamente. HMEs são recrutados para sua cromatina alvo por fatores de transcrição (TFs). Assim, detectar e caracterizar interações diretas entre HMEs e TFs são fundamentais para melhor compreensão de sua função e especificidade. Esses estudos seriam mais biologicamente relevantes se realizados in vivo dentro de tecidos vivos. Aqui, um protocolo é descrito para visualizar interações em folhas de plantas entre uma histona desubiquitinase vegetal e um fator de transcrição de plantas usando transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), que permite a detecção de complexos entre moléculas de proteína que estão dentro de <10 nm uma da outra. Duas variações da técnica de FRET são apresentadas: SE-FRET (emissão sensibilizada) e AB-FRET (clareamento aceptor), em que a energia é transferida não radiativamente do doador para o aceitador ou emitida radiativamente pelo doador após o fotobranqueamento do aceitador. Ambas as abordagens SE-FRET e AB-FRET podem ser adaptadas facilmente para descobrir outras interações entre outras proteínas na planta.

Introduction

As histonas desubiquitinases vegetais desempenham um papel importante no controle da expressão gênica pela modificação pós-translacional das histonas, especificamente apagando suas marcas de monoubiquitilação1. Até o momento, a OTLD1 é uma das poucas histonas desubiquitinases vegetais caracterizadas em nível molecular em Arabidopsis 2,3. O OTLD1 remove os grupos monoubiquitina das moléculas de histona H2B, promovendo assim a remoção ou adição de acetilação eucromática e modificações de metilação das histonas H3 no gene alvo da cromatina 4,5. Além disso, o OTLD1 interage com outra enzima modificadora da cromatina, a histona lisina desmetilase KDM1C, para afetar a supressão transcricional dos genes-alvo 6,7.

A maioria das enzimas modificadoras da histona não possui capacidades de ligação ao DNA e, portanto, não pode reconhecer seus genes-alvo diretamente. Uma possibilidade é que eles cooperem com proteínas do fator de transcrição de ligação ao DNA que se ligam a essas enzimas e as direcionam para seus alvos de cromatina. Especificamente, em plantas, várias enzimas modificadoras importantes da histona (isto é, histona metiltransferases 8,9, histonas acetiltransferases 10, histonas desmetilases 11 e complexos repressivos Polycomb12,13,14) são conhecidas por serem recrutadas por fatores de transcrição. Consistente com essa ideia, recentemente, foi proposto um possível mecanismo de recrutamento de OTLD1 para os promotores-alvo, que se baseia em interações proteína-proteína específicas de OTLD1 com um fator de transcrição LSH1015.

O LSH10 pertence a uma família de proteínas vegetais ALOG (Arabidopsis LSH1 e Oryza G1) que funcionam como reguladores centrais do desenvolvimento 16,17,18,19,20,21,22. O fato de os membros da família de proteínas ALOG conterem motivos de ligação ao DNA23 e exibirem as capacidades de regulação transcricional 22, localização nuclear19 e homodimerização24 dá mais suporte à noção de que essas proteínas, incluindo o LSH10, podem atuar como fatores de transcrição específicos durante a regulação epigenética da transcrição. Uma das principais técnicas experimentais utilizadas para caracterizar a interação LSH10-OTLD1 in vivo é a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET)15.

FRET é uma técnica de imagem para detectar diretamente interações de curto alcance entre proteínas dentro de <10 nm umas das outras25 dentro de células vivas. Existem duas variações principais da abordagem FRET26: emissão sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) e clareamento aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). No SE-FRET, as proteínas que interagem – uma das quais é marcada com um fluorocromo do doador (por exemplo, proteína fluorescente verde, GFP) e a outra com um fluorocromo aceptor (por exemplo, proteína fluorescente vermelha monomérica, mRFP27,28) – transferem sem radiatividade a energia do estado excitado do doador para o aceitador. Como nenhum fóton é emitido durante essa transferência, é produzido um sinal fluorescente que tem um espectro de emissão radiativa semelhante ao do aceitador. No AB-FRET, as interações proteicas são detectadas e quantificadas com base na elevada emissão radiativa do doador quando o aceptor é permanentemente inativado pelo fotobranqueamento e, portanto, é incapaz de receber a energia não radiativa transferida do doador (Figura 1). É importante ressaltar que a localização subcelular da fluorescência FRET é indicativa da localização das proteínas que interagem na célula.

A capacidade de implantar FRET em tecidos vivos e determinar a localização subcelular das proteínas que interagem simultaneamente com a detecção dessa interação per se, torna FRET a técnica de escolha para estudos e caracterização inicial das interações proteína-proteína in vivo. Uma metodologia de imagem de fluorescência in vivo comparável, a complementação por fluorescência bimolecular (BiFC)29,30,31,32, é uma boa abordagem alternativa, embora, ao contrário do FRET, o BiFC possa produzir falsos positivos devido à montagem espontânea dos repórteres autofluorescentes do BiFC 33, e a quantificação de seus dados seja menos precisa.

Este artigo compartilha a experiência bem-sucedida na implementação das técnicas SE-FRET e AB-FRET e apresenta um protocolo para sua implantação para investigar as interações entre OTLD1 e LSH10 em células vegetais.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 ou GV3101 foram utilizadas para o presente estudo. 1. Construção do vetor FRET Selecione etiquetas fluorescentes para o par FRET doador/aceitador.Use EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ver Tabela de Materiais) para gerar o vetor doador. Use mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (consulte T…

Representative Results

A Figura 2 ilustra os resultados típicos de um experimento SE-FET, no qual os núcleos celulares foram registrados simultaneamente em três canais (ou seja, GFP doador, mRFP aceitador e SE-FRET). Esses dados foram utilizados para gerar imagens de eficiência SE-FRET codificadas em uma escala de pseudo-cores. Nesta escala, a transição do azul para o vermelho corresponde a um aumento na eficiência do FET, uma medida da proximidade proteína-proteína de 0% a 100%. Neste experimento represe…

Discussion

Este protocolo FRET é simples e fácil de reproduzir; também requer um investimento mínimo de fornecimento e utiliza equipamentos padrão para muitos laboratórios modernos. Especificamente, cinco características técnicas principais distinguem a versatilidade deste procedimento. Primeiro, as construções FRET são geradas usando recombinação site-specific, uma abordagem de clonagem que é fácil de usar, produz resultados precisos e economiza tempo em comparação com a clonagem tradicional baseada em enzimas de …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho no laboratório de V.C. é apoiado por doações do NIH (R35GM144059 e R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) e BARD (IS-5276-20) para V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
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Referencias

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Biología molecular. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
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