熱ショックタンパク質90阻害剤の発見のためのマラカイトグリーンアッセイ
Summary
マラカイトグリーンアッセイプロトコルは、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)サプレッサー、およびATP依存性酵素に対する他の阻害剤化合物を発見するための簡単で費用効果の高い方法です。
Abstract
ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、複数の発癌性タンパク質に対するシャペロン効果があるため、有望な抗がん標的です。Hsp90の活性は、アデノシン三リン酸(ATP)をアデノシン二リン酸(ADP)および遊離リン酸に加水分解する能力に依存します。Hsp90のATPアーゼ活性は、そのシャペロン機能に関連しています。ATPはHsp90のN末端ドメインに結合し、その結合を破壊することがHsp90の機能を抑制する上で最も成功した戦略であることがわかった。ATPアーゼ活性は、ATP加水分解によって形成される遊離リン酸の量を決定する比色マラカイトグリーンアッセイによって測定することができる。ここでは、マラカイトグリーンリン酸測定キットを用いて酵母Hsp90のATPase活性を測定する手順について説明する。さらに、ゲルダナマイシンを真正な阻害剤として服用することによるHsp90阻害剤の発見のための詳細な指示書が提供される。最後に、酵母Hsp90に対する阻害剤分子のハイスループットスクリーニング(HTS)を介したこのアッセイプロトコルの適用について説明します。
Introduction
ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、癌の発症と進行に関与するタンパク質の安定性を維持する分子シャペロンです。さらに、抗悪性腫瘍剤に対する耐性の発達に関与するタンパク質もHsp901のクライアントである。Hsp90は、全タンパク質の2%未満を占める可能性のある正常細胞と比較して、すべての癌細胞タイプ(細胞タンパク質の>90%)に遍在的に過剰発現しています。さらに、がん細胞のHsp90はコシャペロンとの複合体に存在しますが、正常細胞では、主に遊離で複合体のない状態で存在します2,3。近年、いくつかのHsp90阻害剤が、インビトロおよびインビボ研究において老化細胞除去効果を有することが実証されており、マウスの寿命を有意に改善している4,5,6。前述のすべての発見は、Hsp90阻害剤が複数の種類の癌に有効であり、副作用が少なく、耐性を発症する可能性が低いという事実を実証しています。Hsp90のシャペロン機能は、Hsp90のN末端ドメインにATPを結合し、それをADPと遊離リン酸に加水分解することによって達成されます7。Hsp90のATP結合ポケットに競合的に結合する低分子は、タンパク質のシャペロン化効果を抑制することに成功した。今日まで、これはHsp90阻害のための最良の戦略であり、そのような阻害剤が臨床試験に達したという事実によって裏付けられています8。そのうちの1つであるピミテスピブは、2022年6月に消化管間質腫瘍(GIST)の治療薬として日本で承認されました9。これは、シャペロンの創薬性が1994年に確立されて以来、承認された最初のHsp90阻害剤です10。
マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順であり、目的のターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています11。このアッセイは、小規模なラボスケールのセットアップやHTS 12、13、14、15、16、17でのHsp90阻害剤のスクリーニングに成功しています。このアッセイは、Hsp90のATPアーゼ活性により形成される遊離無機リン酸を測定する比色法を使用します。この定量の基礎は、遊離リン酸とモリブデンの間にリンモリブデン酸錯体が形成され、その後マラカイトグリーンと反応して緑色を生成することです(図1)。この急速な発色は、分光光度計またはプレートリーダー上で、600〜660nmの間で測定される18,19。
本プロトコールでは、酵母Hsp90を用いたマラカイトグリーンアッセイを実施する手順およびその後のシャペロンに対する阻害剤の同定が記載されている。Hsp90の創薬性が最初に確立された天然物分子であるゲルダナマイシン(GA)は、本物の阻害剤として摂取されました10。HTSは、テスト用の多数の分子が利用可能であるため、現在の創薬プログラムの不可欠な部分になっています。この技術は、Covid-19感染症を治療するための薬物の転用が緊急に必要であるため、過去2年間でより重要性を増しています20,21。そこで、マラカイトグリーンアッセイ法を採用した酵母Hsp90タンパク質に対するHTSの分子について詳細な概要が提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90は、新規抗がん剤分子の発見のための重要な標的である。1994年に創薬性が確立されて以来、10、18分子が臨床試験に達しています。現在、7つの分子が単独で、または組み合わせて、臨床試験のさまざまな段階にあります22。このような小分子はすべてN末端ATP結合阻害剤である。シャペロンを阻害する他の手段(C末端阻害剤、ミドルドメイン阻害剤)は、N?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、科学情報通信部(NRF-2019H1D3A1A01102952)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)のポスドクフェローである韓国研究フェローシップ(KRF)プログラムの支援を受けました。著者らは、KISTの壁内助成金と海洋水産省の助成金番号2MRB130に、このプロジェクトに財政支援を提供してくれたことに感謝しています。
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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