Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.
Abstract
O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.
Introduction
O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.
O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da fo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
Referencias
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