in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング
Summary
現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin vivoで高解像度のサブコンパートメントカルシウムイメージングのための非レシオメトリックアプローチを説明しています。
Abstract
カルシウム(Ca2+)イメージングは、主に神経活動を調べるために使用されてきましたが、細胞内Ca2+の取り扱いが細胞内シグナル伝達の重要な要素であることがますます明らかになっています。ニューロンを本来の無傷の回路で研究できるin vivoでの細胞内Ca2+ダイナミクスの視覚化は、複雑な神経系では技術的に困難であることが証明されています。線虫Caenorhabditis elegansの透明性と比較的単純な神経系は、蛍光タグとインジケーターの細胞特異的発現とin vivo視覚化を可能にします。これらの中には、細胞質ならびにミトコンドリアなどの様々な細胞内区画で使用するために改変された蛍光指示薬がある。このプロトコルは、個々の樹状突起スパインおよびミトコンドリアのレベルまでのCa2+動態の分析を可能にする細胞内分解能でin vivoでの非レシオメトリックCa2+イメージングを可能にします。ここでは、異なるCa2+親和性を有する2つの利用可能な遺伝的にコードされた指標を使用して、単一の興奮性介在ニューロン(AVA)の細胞質またはミトコンドリアマトリックス内の相対的なCa2+レベルを測定するためのこのプロトコルの使用を実証する。C. elegansで可能な遺伝子操作と縦断的観察とともに、このイメージングプロトコルは、Ca 2+の取り扱いがニューロン機能と可塑性をどのように調節するかに関する質問に答えるのに役立つ可能性があります。
Introduction
カルシウムイオン(Ca2+)は、多くの細胞型において非常に汎用性の高い情報担体です。ニューロンにおいて、Ca2+は、神経伝達物質の活動依存的放出、細胞骨格運動性の調節、代謝過程の微調整、ならびに適切なニューロンの維持および機能に必要な他の多くのメカニズムに関与している1,2。効果的な細胞内シグナル伝達を確実にするために、ニューロンは細胞質3において低い基底Ca2+レベルを維持しなければならない。これは、小胞体(ER)やミトコンドリアなどの細胞小器官へのCa2+の取り込みを含む、協調的なCa2+処理メカニズムによって達成されます。これらのプロセスは、原形質膜におけるCa2+透過性イオンチャネルの配置に加えて、ニューロン全体にわたって不均一なレベルの細胞質Ca2+をもたらす。
安静時およびニューロン活性化中のCa2+不均一性は、Ca2+依存性メカニズムの多様で場所特異的な調節を可能にします1。Ca2+の濃度特異的効果の一例は、イノシトール1,4,5-三リン酸(InsP3)受容体を介したERからのCa2+の放出である。InsP3と組み合わせた低Ca2+レベルは、受容体のカルシウム透過性細孔の開口に必要とされる。あるいは、高いCa2+レベルは、受容体4を直接的および間接的に阻害する。適切な神経機能のためのCa2+恒常性の重要性は、細胞内Ca2+の取り扱いおよびシグナル伝達の破壊が神経変性障害および自然老化の病因の初期段階であることを示唆する証拠によって裏付けられている5,6。具体的には、ERおよびミトコンドリアによる異常なCa2+の取り込みおよび放出は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病における神経機能障害の発症に関連している6,7。
自然老化または神経変性中のCa2+異相変の研究には、天然の細胞構造(すなわち、シナプスの配置およびイオンチャネルの分布)が維持されている生きている無傷の生物における細胞内分解能でのCa2+レベルの縦断的観察が必要である。この目的のために、このプロトコルは、高い空間的および時間的分解能でin vivoでCa2+ダイナミクスを記録するために、容易に入手可能で遺伝的にコード化された2つのCa2+センサーの使用に関するガイダンスを提供します。C. elegansに記載の方法を用いて得られた代表的な結果は、単一ニューロンの細胞質またはミトコンドリアマトリックスにおけるCa2+指示薬の発現が、単一のスパイン様構造および個々のミトコンドリア内のCa2+レベルを識別する追加能力を有するCa2+動態を示す蛍光画像(最大50Hz)の迅速な取得をどのように可能にするかを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された方法を実施する際の最初の考慮事項は、所与の研究課題に対して理想的な特性を有するCa2+指標の選択を含む。細胞質Ca2+指示薬は典型的にはCa2+に対して高い親和性を有し、Ca2+に対するこれらの指示薬の感受性は動態(オン/オフ率)に反比例する16,17。これは、Ca2+感度または動力学のいずれかを関心…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01-NS115947がF. Hoerndliに授与)によってサポートされました。また、pAS1プラスミドを提供してくれたAttila Stetak博士にも感謝します。
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
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