Epimediiフォリウムマトン油加工技術の最適化とゼブラフィッシュ胚発生への影響の検証
Summary
このプロトコルでは、Box-Behnken実験計画応答表面法を適用してEpimedii folium(EF)の羊油処理技術を最適化し、ゼブラフィッシュの胚発生に対する粗水および最適化された水抽出EFの影響を予備的に調査しました。
Abstract
伝統的な漢方薬(TCM)として、エピメディフォリウム(EF)は、>2,000年前の医学と食品の歴史があります。臨床的には、マトンオイルで処理されたEFは薬としてよく使用されます。近年、EFを原料とした製品の安全性リスクや副作用の報告が徐々に増加しています。処理により、TCMの安全性を効果的に向上させることができます。TCM理論によれば、マトンオイル処理はEFの毒性を軽減し、腎臓に対するその調子効果を高めることができます。しかし、EFマトンオイル加工技術の体系的な研究と評価は不足しています。この研究では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を使用して、複数のコンポーネントの内容を評価することにより、処理技術の主要なパラメーターを最適化しました。その結果、EFの最適なマトン油加工技術は、マトンオイルを120°C±10°Cで加熱し、粗EFを加え、均一に光沢があるまで189°C±10°Cまで穏やかに炒め、取り除いて冷却することであることが示された。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイルを使用する必要があります。粗精製および羊油処理EFの水性抽出物の毒性および催奇形性をゼブラフィッシュ胚発生モデルで比較した。結果は、粗ハーブグループがゼブラフィッシュ奇形を引き起こす可能性が高く、その半分の最大致死EF濃度が低いことを示しました。結論として、最適化されたマトンオイル処理技術は安定していて信頼性が高く、再現性も良好でした。EFの水性抽出物は、特定の用量ではゼブラフィッシュ胚の発生に対して毒性があり、毒性は加工薬よりも生薬の方が強かった。結果は、マトン油処理が粗EFの毒性を低下させることを示した。これらの知見は、マトン油処理EFの品質、均一性、および臨床的安全性を向上させるために使用できます。
Introduction
エピメディイフォリウム(EF)は、イカリソウブレビコルヌマキシム、イカリソウサジタタム(Sieb. et Zucc)の乾燥葉です。マキシム、エピカリソウ思春期マキシム、またはエピメディウムコリアナムナカイ。EFは、骨粗鬆症、更年期障害、乳房のしこり、高血圧、冠状動脈性心臓病、およびその他の疾患の治療に使用できます1。伝統的な中国医学(TCM)として、EFは2,000年以上の医学と食品の歴史があります。その低価格と腎臓の緊張の顕著な効果のために、それは医薬品や健康食品に広く使用されています。EFは、羊肉油で炒めて加工されますが、これは劉宋時代の2年にレイシャオによって書かれたレイゴン加工理論で最初に説明されたプロセスです。粗EFとEF炒めの効果はかなり異なります。粗EFは主にリウマチを払拭しますが、炒めたEFは腎臓を温めて陽を強化します3。現在、EFは医薬品や健康食品の原料として広く使用されています。中国の特許医薬品は399件、輸入健康食品は9件、EFを原料とする国内健康食品は455件です。この医薬品は大きな応用の見通しがあります。しかし、近年、EFを原料とした健康食品や中国特許医薬品による副作用やヒト肝障害の報告が増えており、関連する毒性試験5,6,7では、EFを原料とする潜在的な安全性リスクが報告されています。
漢方加工とは、毒性を効果的に軽減または排除し、TCMの安全性を向上させることができる製薬技術を指します。EFの伝統的な加工方法は、マトン油で炒めることで、EFの毒性を軽減し、腎臓を温め、陽8を促進する効果を高めます。この処理方法は、中国薬局方および各種処理仕様に含まれています1.EFのプロセスは次のようにのみ指定されています:EF100 kgごとに20 kgの羊水(精製)が追加され、均一で光沢がある1になるまで穏やかに焼成されます。上記の標準には厳密なEF処理メソッドパラメータがないため、一貫性を提供するためにローカル処理仕様が統一されていません。したがって、EFプロセスの体系的な研究を行うことは有用でしょう。本論文では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を用いてEFの処理技術を最適化した。
Box-Behnken実験計画は、工程の因子を最適化するために通常使用される方法です。抽出パラメータは、重回帰式適合因子と効果値の間の関数関係を確立することによって最適化できます。最近、この方法は、TCM抽出5、6、7および処理9、10、11の研究に広く使用されています。塩加工ソラレ科フルクタス12、ワイン加工フルータス13、ローストシナモミラムルス14など、ボックスベンケン設計に従った塩加工、ワイン加工、炒め物を含むTCM調製方法がさまざまな研究で報告されています。この方法は、テスト時間が短縮され、テスト精度が高く、多要素およびマルチレベルのテストに適しています。この方法は、直交計画試験方法よりも単純であり、均一設計方法15よりも包括的である。得られた関係は、テスト範囲内の任意のテストポイントの予測値を決定することができ、これは大きな利点である。ゼブラフィッシュモデルを使用して、EFが処理後に毒性が低いかどうかをテストできます。
TCM毒性試験において、ゼブラフィッシュモデルには、細胞実験のハイスループットとげっ歯類実験との類似性という2つの利点があります16。このモデルは、サイズが小さく、産卵率が高く、繁殖サイクルが短く、繁殖が容易であることが特徴です。このモデルは、細胞培養プレートでの大規模な同期実験に使用でき、実験薬の投与量が少なく、実験サイクルが短く、コストが低く、実験プロセス全体の観察と操作が容易です17。ゼブラフィッシュの胚は透明で急速に成長します。したがって、異なる発生段階における内臓組織に対する薬物の毒性および催奇形性効果は、顕微鏡下で直接観察することができる18。ゼブラフィッシュとヒトの遺伝子相同性は85%にもなります18。ゼブラフィッシュのシグナル伝達経路はヒトのそれと類似している18。ゼブラフィッシュの生物学的構造と生理学的機能は、哺乳類のものと非常に類似しています18。したがって、薬物検査用のゼブラフィッシュモデルは、信頼性が高く、ヒトに完全に適用可能な実験動物を提供することができます19。
本研究では,イカリイン,エピメジンA,エピメジンB,エピメジンC,バオフオシドIの含有量を評価指標として,EF加工技術で使用するマトン油の量と温度,揚げ温度を最適化するためにBox-Behnken設計応答曲面法を用いた。ゼブラフィッシュモデルを用いて、EFに対する処理の減衰効果を評価するために、処理前後のゼブラフィッシュ胚発生に対するEF水抽出物の効果を予備的に調査した。
Protocol
Representative Results
Discussion
独立変数とその水準の決定
EF加工技術は、2020年版の中国薬局方と、全国の26の省、市、自治区が発行している地元の漢方加工仕様書にのみ記載されています1。説明には、マトンオイルを取り、加熱して溶かし、EF細切りを加え、均一で光沢が出るまでゆっくりと火で炒め、取り出して冷まします。さらに、イカリソウ100kgごとに20kg(20%と略して)のマトンオイル…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、重慶中医薬アカデミーの基礎科学研究事業プロジェクト(プロジェクト番号:jbky20200013)、重慶科学研究機関のパフォーマンスインセンティブガイダンスプロジェクト(プロジェクト番号:cstc2021jxjl 130025)、および重慶市衛生委員会の主要規律建設プロジェクトによってサポートされています中国マテリアメディカ処理。
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
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