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Biología

Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte espontánea in vitro

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Este protocolo detalla la preparación de CLON-G para extender la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días y proporciona un procedimiento confiable para evaluar la muerte de neutrófilos con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia confocal.

Abstract

El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h, lo que limita la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos. Nuestra investigación previa indicó que múltiples vías podrían mediar la muerte espontánea de los neutrófilos. Se desarrolló un cóctel dirigiéndose simultáneamente a estas vías, caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-oxidante-necroptosis inhibición más factor estimulante de colonias de granulocitos (CLON-G), que prolongó la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días sin comprometer significativamente la función de los neutrófilos. Al mismo tiempo, también se desarrolló un protocolo confiable y estable para evaluar y evaluar la muerte por neutrófilos. En este trabajo, mostramos que CLON-G puede prolongar la vida útil de los neutrófilos in vitro a más de 5 días, y exhibimos el alargamiento de la vida útil de los neutrófilos con FACS y microscopía de fluorescencia confocal. Este informe presenta procedimientos para la preparación de CLON-G y muestra un ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos, que puede utilizarse para el estudio de neutrófilos y para interrogar posteriormente la muerte de neutrófilos, proporcionando así un recurso confiable para la comunidad de neutrófilos.

Introduction

Se sabe que los neutrófilos comprenden un arsenal de abundantes gránulos citoplasmáticos, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, enzimas antimicrobianas y varios orgánulos que defienden contra los microbios invasores; Además, son altamente móviles y son las primeras células reclutadas en el sitio de inflamación, lo que significa que los neutrófilos son la primera línea de defensa del sistema inmune innato 1,2. Por lo tanto, la terapia de transfusión de granulocitos se ha convertido en un tratamiento clínico prometedor para las infecciones relacionadas con neutropenia para aumentar transitoriamente la inmunidad de los neutrófilos 3,4,5. Descubrimientos recientes han demostrado claramente que los neutrófilos también funcionan como efectores multifacéticos en muchos escenarios fisiopatológicos6. El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h y, por lo tanto, la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos son tremendamente difíciles debido a las limitaciones relacionadas con la manipulación genética estable y el almacenamiento a largo plazo 7,8,9,10,11 . Hay algunas líneas celulares que pueden mostrar parcialmente algunas funciones de neutrófilos, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 y células madre pluripotentes inducidas12. Estas líneas celulares pueden lograr una edición y criopreservación de genes efectivas; Sin embargo, todavía difieren enormemente de los neutrófilos primarios y, por lo tanto, no pueden recapitular fielmente las funciones de los neutrófilos13. Por lo tanto, la mayor parte de la investigación en este campo todavía se basa en neutrófilos primarios recién aislados. El campo todavía se basa en la generación de ratones knock-out condicionales costosos y lentos para investigar funciones genéticas específicas en neutrófilos, pero actualmente no existen modelos humanos.

Habiendo puesto nuestro esfuerzo en explorar los procesos heterogéneos involucrados en la muerte de neutrófilos y las múltiples vías que regulan estos procesos14,15, recientemente se ha descrito un nuevo tratamiento denominado CLON-G (caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-inhibición de la necroptosis oxidante más factor estimulante de colonias de granulocitos) 16. CLON-G consiste en Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartil-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La muerte espontánea de neutrófilos está mediada por múltiples vías, incluyendo apoptosis, necroptosis y piroptosis. Q-VD-oph inhibe la apoptosis de los neutrófilos como un inhibidor de pan-caspasa al dirigirse a la caspasa 1, caspasa 3, caspasa 8 y caspasa9 17. La necroptosis de neutrófilos depende de una vía de señalización que involucra la proteína quinasa-1 que interactúa con el receptor (RIPK1) y la proteína similar al dominio de la quinasa de linaje mixto (MLKL)18. Como inhibidor de RIPK1, los Nec-1 inhiben la necroptosis de los neutrófilos. Hsp70 y DFO pueden inhibir la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), lo que podría inducir la apoptosis de neutrófilos19 y la piroptosis20. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en la muerte de neutrófilos al mediar LMP19 y apoptosis21 e inhibir las señales de supervivencia22. Como antioxidante que puede reducir la acumulación de ROS, NAC retrasa la muerte de neutrófilos. Como factor de crecimiento, el G-CSF activa las señales de supervivencia de los neutrófilos e inhibe la apoptosis inducida por calpaína23,24. Al dirigirse simultáneamente a múltiples vías de muerte espontánea de neutrófilos, la vida útil de los neutrófilos puede extenderse efectivamente a más de 5 días sin comprometer su función. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos. Mientras tanto, con base en el conocimiento de la muerte de neutrófilos, los protocolos actualmente aprobados para los ensayos de muerte celular pueden causar daños inesperados a los neutrófilos14, por lo que estos protocolos se han refinado para ser más apropiados para los estudios de neutrófilos. Este informe proporciona protocolos detallados para el cultivo de neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte celular in vitro de neutrófilos de ratón utilizando citometría de flujo e imágenes de fluorescencia. CLON-G es eficaz tanto en neutrófilos de ratón como humanos; Sin embargo, aquí se demuestran las muestras de ratón para simplificar este protocolo. La concentración de NAC es de 1 mM para neutrófilos de ratón y de 10 μM para neutrófilos humanos. Hsp70 es específico de la especie y, por lo tanto, debe utilizarse de acuerdo con la fuente del neutrófilo. Para este protocolo, no importa si los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica o de la médula ósea y cómo se aíslan.

Para el presente estudio, se aislaron neutrófilos de médula ósea de ratón para lograr suficientes neutrófilos para los experimentos, ya que se pueden obtener aproximadamente 1 x 10 7-1.5 x 107 neutrófilos de la médula ósea, mientras que solo se pueden aislar 1 x 10 6 neutrófilos de la sangre periférica de un solo ratón C57BL /6 de 8-12 semanas de edad (de cualquier sexo). La centrifugación por gradiente se llevó a cabo para evitar posibles daños y activación por la estimulación mecánica de la clasificación FACS o la clasificación MACS.

Protocol

El Boston Children’s Hospital y el Comité Estatal de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Clave de Hematología Experimental (SKLEH) aprobaron y supervisaron todos los procedimientos. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del cultivo de neutrófilos con CLON-G y el ensayo de muerte in vitro . 1. Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G NOTA: Todas las operaciones y materiales mencionado…

Representative Results

La morfología teñida con Wright-Giemsa (Figura 2A-D) y los fenotipos FACS (Figura 2E-J) de los neutrófilos tratados con CLON-G no se vieron afectados. La viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 h fue de aproximadamente 90% + según el análisis de citometría de flujo (Figura 3) y los ensayos de imagen fluorescente (Figura…

Discussion

Los neutrófilos desempeñan un papel vital en la inmunidad innata y adaptativa, y su homeostasis está estrictamente regulada. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre periférica humana, y tienen un recambio robusto y rápido. Un adulto sano puede liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diarios de la médula ósea28. La muerte de los neutrófilos se ha convertido así en uno de los enigmas desconcertantes de este campo, y se ha dedicado mucho esfuerzo a comprenderlos m…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación del Laboratorio de Ecosistemas Celulares de Haihe (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), el Fondo de Innovación para Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), el Fondo Especial de Investigación para Universidades Centrales, el Colegio Médico de la Unión de Pekín (3332022062) y el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Sichuan (NO. 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
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Referencias

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Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
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