Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule
Summary
L’aumento dei biomarcatori molecolari da testare per la gestione della cura del carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) ha spinto lo sviluppo di metodi di rilevamento molecolare rapidi e affidabili. Descriviamo un flusso di lavoro per la valutazione dell’alterazione genomica per i pazienti NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ultraveloce.
Abstract
Il numero di alterazioni molecolari da testare per la terapia mirata dei pazienti con carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) è aumentato significativamente negli ultimi anni. L’individuazione di anomalie molecolari è obbligatoria per la cura ottimale dei pazienti NS-NSCLC avanzati o metastatici, consentendo la somministrazione di terapie mirate con un miglioramento della sopravvivenza globale. Tuttavia, questi tumori sviluppano meccanismi di resistenza che sono potenzialmente bersaglio utilizzando nuove terapie. Alcune alterazioni molecolari possono anche modulare la risposta al trattamento. La caratterizzazione molecolare di NS-NSCLC deve essere eseguita in un breve tempo di risposta (TAT), in meno di 10 giorni lavorativi, come raccomandato dalle linee guida internazionali. Inoltre, l’origine delle biopsie tissutali per l’analisi genomica è diversa e le loro dimensioni diminuiscono continuamente con lo sviluppo di metodi e protocolli meno invasivi. Di conseguenza, i patologi sono chiamati a eseguire tecniche molecolari efficaci mantenendo una strategia di diagnosi efficiente e rapida. In questo articolo, descriviamo il flusso di lavoro ultraveloce di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su ampliconi utilizzato nella pratica di routine quotidiana per la diagnosi dei pazienti con NS-NSCLC. Abbiamo dimostrato che questo sistema è in grado di identificare gli attuali bersagli molecolari utilizzati in medicina di precisione in oncologia toracica in un TAT appropriato.
Introduction
Nell’ultimo decennio, lo sviluppo di terapie mirate e immunoterapeutiche ha aumentato significativamente la sopravvivenza globale (OS) del carcinoma polmonare non a piccole cellule non squamoso (NS-NSCLC)1,2. A questo proposito, il numero di geni obbligatori e bersagli molecolari da analizzare nel trattamento di NS-NSCLC è aumentato negli ultimi anni 3,4.
Le attuali linee guida internazionali raccomandano di testare EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET alla diagnosi di NS-NSCLC5 avanzato. Inoltre, poiché nuovi farmaci hanno recentemente dato risultati molto promettenti negli studi clinici, ulteriori alterazioni genomiche saranno presto sottoposte a screening in un certo numero di geni aggiuntivi, in particolare KRAS e HER2, insieme a BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 e NUT 6,7,8,9. Inoltre, lo stato di diversi geni associati, come STK11, KEAP1 e TP53 può essere di grande interesse per una migliore previsione della risposta o della resistenza ad alcune terapie mirate e/o inibitori del checkpoint immunitario (ICI)10,11,12.
È importante sottolineare che le alterazioni molecolari devono essere segnalate senza ritardi significativi per garantire un attento processo decisionale clinico. L’assenza di caratterizzazione molecolare di un tumore può portare all’inizio di terapie non mirate come la chemioterapia con/senza immunoterapia, portando a una strategia di trattamento non ottimale, poiché la risposta alla chemioterapia è limitata nei pazienti con alterazioni perseguibili, come mutazioni di EGFR o fusioni geniche13.
Inoltre, l’attuale sviluppo di terapie/immunoterapie mirate in contesti neoadiuvanti e/o adiuvanti potrebbe portare alla ricerca sistematica, almeno, di alterazioni di EGFR e ALK in NS-NSCLC in fase iniziale, poiché gli ICI dovrebbero essere somministrati solo nei tumori wild-type per EGFR e ALK14. Ora è anche obbligatorio testare la presenza di mutazioni di EGFR nel NS-NSCLC in fase iniziale, poiché osimertinib (un inibitore tirosin-chinasico di terza generazione di EGFR) può essere utilizzato come terapia adiuvante nel NS-NSCLC15 con mutazione di EGFR.
La strategia per la valutazione dei diversi biomarcatori nel predire la risposta a diverse terapie mirate e/o immunoterapie nei pazienti NS-NSCLC si sta muovendo rapidamente, il che rende l’identificazione di questi biomarcatori sequenzialmente difficile 3,16. A questo proposito, il Next-Generation Sequencing (NGS) è ora l’approccio ottimale per la valutazione parallela ad alto rendimento delle alterazioni geniche in NS-NSCLC 5,17.
Tuttavia, il flusso di lavoro NGS può essere difficile da padroneggiare e può portare a TAT18,19 più lunghi. Pertanto, molti centri eseguono ancora approcci sequenziali (immunoistochimica (IHC), ibridazione fluorescente in situ (FISH) e/o sequenziamento mirato). Tuttavia, questa strategia è limitata in caso di piccole dimensioni del campione e, soprattutto, a causa dell’aumento del numero di mutazioni utilizzabili che devono essere testate in NS-NSCLC20. Pertanto, i metodi di analisi ultrarapidi e semplici che consentono la valutazione rapida delle alterazioni genetiche sono diventati sempre più importanti per un processo decisionale clinico ottimale. Inoltre, i sistemi approvati e accreditati per i test molecolari stanno diventando obbligatori per la prescrizione di specifiche terapie mirate.
In questo articolo, descriviamo un test NGS basato su ampliconi ultraveloce e automatizzato per l’analisi molecolare di NS-NSCLC che viene utilizzato nel Laboratorio di Patologia Clinica e Sperimentale (LPCE), Ospedale Universitario di Nizza, Francia ed è accreditato secondo la norma ISO 15189 dal Comitato di Accreditamento Francese (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). Il COFRAC certifica che il laboratorio soddisfa i requisiti della norma ISO 15189 e delle norme di applicazione COFRAC per le attività di prova/taratura in analisi molecolare in NGS automatizzato su sequenziatore con il pannello eseguito dal laboratorio. L’accreditamento secondo lo standard internazionale riconosciuto ISO 15189 dimostra la competenza tecnica del laboratorio per un ambito definito e il corretto funzionamento di un sistema di gestione appropriato in questo laboratorio. Vengono discussi i vantaggi e i limiti di questo flusso di lavoro, a partire dalla preparazione dei campioni di biopsia tissutale fino all’ottenimento del referto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di un approccio NGS ultraveloce basato su ampliconi come test riflesso per la valutazione dell’alterazione molecolare alla diagnosi di NS-NSLC in qualsiasi stadio è un’opzione ottimale per la rilevazione di tutti i biomarcatori raccomandati dalle linee guida ed emergenti in NS-NSCLC 5,22,23. Mentre i metodi sequenziali (IHC, PCR, FISH) si concentrano solo su geni specifici e possono causare l’esaurimento del materia…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Thermo Fisher Scientific per averci dato la possibilità di utilizzare il loro dispositivo e i loro materiali.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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