Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco
Summary
Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.
Abstract
Los organoides tumorales son modelos tumorales ex vivo tridimensionales (3D) que recapitulan las características biológicas clave de los tejidos tumorales primarios originales. Los organoides tumorales derivados de pacientes se han utilizado en la investigación traslacional del cáncer y se pueden aplicar para evaluar la sensibilidad y la resistencia al tratamiento, las interacciones entre células y las interacciones de las células tumorales con el microambiente tumoral. Los organoides tumorales son sistemas de cultivo complejos que requieren técnicas avanzadas de cultivo celular y medios de cultivo con cócteles específicos de factores de crecimiento y una membrana basal biológica que imita el entorno extracelular. La capacidad de establecer cultivos tumorales primarios depende en gran medida del tejido de origen, la celularidad y las características clínicas del tumor, como el grado tumoral. Además, la recogida de muestras de tejido, la calidad y cantidad del material, así como el correcto biobanco y almacenamiento son elementos cruciales de este procedimiento. Las capacidades técnicas del laboratorio también son factores cruciales a tener en cuenta. Aquí, reportamos un SOP/protocolo validado que es técnica y económicamente factible para el cultivo de organoides tumorales ex vivo a partir de muestras de tejido fresco de origen adenocarcinoma de páncreas, ya sea a partir de tejido fresco de donante de paciente resecado primario o xenoinjertos derivados del paciente (PDX). La técnica descrita en este documento se puede realizar en laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos y ratones y está diseñada para una amplia aplicación en el campo de la oncología traslacional.
Introduction
Los organoides tumorales son cultivos organizados tridimensionales (3D) ex vivo que se derivan de tejido tumoral fresco y proporcionan modelos de cáncer. Los organoides tumorales recapitulan las características biológicas clave del tumor primario original 1,2,3,4 y pueden expandirse hasta varios meses y criopreservarse, de forma similar a las líneas celulares inmortalizadas convencionales. Los organoides tumorales proporcionan un biobanco de modelos tumorales derivados de pacientes para la medicina traslacional/personalizada5 y representan un avance importante en los sistemas/modelos de biología de células cancerosas. Los organoides tumorales derivados del paciente pueden utilizarse como modelos ex vivo para predecir la eficacia de las terapias oncológicas/farmacológicas (neo)adyuvantes, para las cuales se establecen cultivos a partir de tejido tumoral fresco y se realizan ensayos de sensibilidad a los fármacos o farmacotipado específicos para cada paciente con el fin de identificar agentes eficaces para las líneas terapéuticas posteriores 1,4. Además, los organoides tumorales superan la limitación de la disponibilidad de tejido tumoral primario y, lo que es más importante, proporcionan un excelente sistema alternativo o complementario a los modelos de ratón in vivo, como los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)2. La complejidad de los organoides tumorales aumenta si las células tumorales primarias se combinan con células estromales que se encuentran en el microambiente tumoral (TME), como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células endoteliales y las células inmunitarias, que imitan el funcionamiento y la celularidad compleja del tumor primario. Se han establecido organoides tumorales para muchos tipos de tumores utilizando protocolos estandarizados 6,7,8,9,10. La propagación de organoides a partir de diferentes tumores sólidos, incluyendo tejido colorrectal y de cáncer de mama, está bien establecida y es técnicamente asequible 11,12,13,14,15.
Las resecciones quirúrgicas de tumores o biopsias tumorales proporcionan muestras de tejido tumoral primario. Idealmente, las muestras de tejido tumoral deben provenir del centro de la masa tumoral o del borde invasor del tumor, así como del tejido de aspecto normal adyacente al tumor. En comparación con los cultivos 2D convencionales, los organoides tumorales requieren varios “complementos”, incluida una membrana basal biológica (como Matrigel, hidrogel o un andamio a base de colágeno), que imita la TME extracelular, y un medio de crecimiento líquido que suministra nutrientes y factores de crecimiento específicos y apoya la proliferación celular y la viabilidad en el cultivo16.
Los pasos más básicos en el cultivo celular primario son el lavado del tejido en solución salina para evitar la contaminación, el corte/digestión mecánica del tumor en pequeños trozos de 1-3mm3 y el tratamiento con colagenasa para la digestión enzimática del tejido. A continuación, la mezcla digerida se filtra para eliminar fragmentos de tejido grandes, se resuspende en una membrana basal biológica como Matrigel, y se siembra como cúpulas en placas de cultivo de baja adherencia para mejorar el crecimiento sin adherencia. Los domos de la matriz de la membrana basal se cubren con medio de cultivo líquido y se suplementan con glutamina y antibióticos para evitar la contaminación, así como con factores de crecimiento específicos según el tipo de tejido 7,8,9,16,17. También se pueden aislar otras células relevantes presentes en el tumor a granel y en la EMT, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células inmunitarias. Esta técnica, que ha sido revisada recientemente18, permite el establecimiento de cocultivos con diferentes tipos celulares para estudiar la respuesta a la terapia en un entorno tumoral más “realista”. Además, se pueden estudiar las interacciones célula-célula y la interacción entre las células tumorales y los componentes de la matriz biológica circundante.
La tasa de éxito reportada para el establecimiento de organoides tumorales utilizando tejido fresco de biopsias o tejido tumoral gastrointestinal resecado es de alrededor del 50%11, y la tasa de éxito de este último depende en gran medida del tipo de tejido y el origen4, particularmente el grado tumoral y la celularidad general del tumor. Los modelos tumorales tridimensionales tienen una complejidad variable, desde simples agregados unicelulares hasta modelos de ingeniería altamente complejos que constan de varios tipos de células. La terminología utilizada para describir los cultivos 3D en la literatura es muy inconsistente 19,20,21, ya que se utilizan diferentes términos como esferoides, tumoresferas y organoides, aunque la diferencia entre ellos no está clara. Como aún no se ha llegado a un consenso claro sobre la definición, en este artículo se describe un organoide tumoral como un cultivo organizado de células tumorales incrustado en una membrana basal biológica.
En este artículo, se presenta un protocolo validado para el establecimiento de organoides tumorales a partir de muestras de tejido fresco procedentes de adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) resecado primario fresco o derivado de PDX, y este protocolo se puede realizar en la mayoría de los laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos. Este protocolo ha sido adaptado de varios protocolos reportados de última generación que se utilizan actualmente para establecer organoides tumorales o tumoroides a partir de tejido tumoral digestivo de los grupos de David Tuveson9, Hans Clevers8 y Aurel Perren7.
Este protocolo no analiza cómo se recolecta el tejido fresco. Para obtener tejido tumoral humano fresco de alta calidad, es importante tener una coordinación eficiente entre los cirujanos que extraen el tejido y el departamento de patología que extrae la muestra de tejido para el cultivo de organoides. Del mismo modo, cuando se utiliza PDX como fuente de tejido fresco, también es importante una coordinación eficiente con la persona que recolecta la muestra de tejido. Es fundamental obtener la muestra de tejido lo más rápido posible (dentro de los 30-60 minutos posteriores al momento de la recolección) para mantener una alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los grandes avances en las terapias farmacológicas contra el cáncer son un reto, ya que la probabilidad de aprobación de fármacos en ensayos clínicos oncológicos de fase I es del 5,1%, que es la más baja de todos los tipos de enfermedades23. La razón principal es que el cáncer es muy heterogéneo y, por lo tanto, las cohortes de pacientes no responden de manera uniforme como se espera al tratamiento dado, lo que pone de manifiesto que se necesita un enfoque más personalizado. Los cultivo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio ha contado con el apoyo de la Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo a la I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.º 857381, el proyecto VISION (Estrategias para fortalecer la excelencia científica y la capacidad de innovación para el diagnóstico precoz de cánceres gastrointestinales), Convocatoria intramuros de nuevos proyectos de investigación para investigadores clínicos y grupos de investigación emergentes IRYCIS (2021/0446), Proyecto Organoides Derivados del Paciente 2.0 (CIBERONC) y el proyecto TRANSCAN II Convocatoria JTC 2017 “Establecimiento de un algoritmo para el diagnóstico precoz y seguimiento de pacientes con tumores neuroendocrinos pancreáticos (NExT)”, subvención número 1.1.1.5/ERANET/20/03. Las muestras biológicas utilizadas en este protocolo fueron proporcionadas por el Biobanco Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integradas en la Plataforma de Biobancos y Biomodelos del ISCIII (PT20/00045). También nos gustaría agradecer a Yvonne Kohl, Agapi Kataki, Vita Rovita y Thorsten Knoll por su inestimable apoyo para desarrollar este protocolo como parte de los proyectos NExT y VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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