Levensvatbaarheidstest van Trichoderma stromaticum Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen

Summary

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het evalueren van de fagocytose en klaringsmogelijkheden van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed gestimuleerd met Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Macrofagen vormen een cruciale verdedigingslinie en zijn verantwoordelijk voor het voorkomen van de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Conidiumfagocytose is een sleutelproces dat het mogelijk maakt om de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken die betrokken zijn bij interacties tussen macrofagen en pathogenen, evenals voor het bepalen van het tijdstip van overlijden van geïnternaliseerde conidiën. De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen zijn mechanismen van schimmelvirulentie. Hier rapporteren we de methoden die kunnen worden gebruikt voor de analyse van de fagocytose, klaring en levensvatbaarheid van T. stromaticum conidia, een schimmel die wordt gebruikt als biologisch bestrijdingsmiddel en biomeststof en in staat is om menselijke infecties te veroorzaken. Het protocol bestaat uit 1) Trichoderma-kweek , 2) wassen om conidia te verkrijgen, 3) de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) met behulp van de polysucrose-oplossingsmethode en de differentiatie van de PBMC’s in macrofagen, 4) een in vitro fagocytosemethode met behulp van ronde glazen dekglaasjes en kleuring, en 5) een klaringstest om de levensvatbaarheid van conidia na conidia-fagocytose te beoordelen. Samengevat kunnen deze technieken worden gebruikt om de efficiëntie van het opruimen van schimmels van macrofagen te meten.

Introduction

Het geslacht Trichoderma (Orde: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) is samengesteld uit alomtegenwoordige, saprofytische schimmels die parasieten zijn van andere schimmelsoorten en in staat zijn om een reeks commercieel nuttige enzymen te produceren¹. Deze schimmelsoorten worden gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten², de productie van cellulose³, ethanol, bier, wijn en papier⁴, in de textielindustrie⁵, de voedingsindustrie⁶ en in de landbouw als biologische bestrijders ^7,8. Naast de industriële belangstelling voor deze schimmelsoorten, heeft het toenemende aantal infecties bij mensen sommige Trichoderma-soorten de status van opportunistische^{pathogenen gegeven}.

Trichoderma spp. groeit snel in cultuur, met aanvankelijk witte en donzige kolonies die groengeel tot donkergroen worden¹⁰. Ze zijn aangepast om te leven in een breed scala aan pH- en temperatuuromstandigheden, en de opportunistische soorten zijn in staat om te overleven bij fysiologische pH en temperaturen en zo verschillende menselijke weefsels te koloniseren 11,12,13. Belangrijk is dat de stijging van het infectiepercentage van Trichoderma spp. kan in verband worden gebracht met virulentiefactoren, en deze zijn niet goed bestudeerd. Bovendien zijn studies die zich richten op het begrijpen van de immuunrespons tegen opportunistische Trichoderma-soorten nog steeds zeldzaam.

Tijdens een infectie vertegenwoordigen macrofagen, samen met neutrofielen, de verdedigingslinie die verantwoordelijk is voor fagocytose en voorkomen ze dus de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Met behulp van patroonherkenningsreceptoren, zoals Toll-achtige receptoren en C-type lectinereceptoren, fagocytose macrofagen schimmels en verwerken ze tot fagolysosomen, waardoor een respiratoire uitbarsting, de afgifte van pro-inflammatoire cytokines en de vernietiging van de gefagocyteerde micro-organismen wordt bevorderd¹⁴. Het mechanisme van fagocytose kan echter worden beïnvloed en ontweken door verschillende microbiële strategieën, zoals de grootte en vorm van de schimmelcellen; de aanwezigheid van capsules die fagocytose belemmeren; vermindering van het aantal fagocytose-inducerende receptoren; de hermodellering van de structuur van actinevezels in het cytoplasma; het belemmeren van de vorming van pseudopodia; en fagosoom of fagolysosoom ontsnappen na het fagocytoseproces¹⁴.

Veel ziekteverwekkers, waaronder Cryptococcus neoformans, gebruiken macrofagen als een niche om in de gastheer te overleven, zich te verspreiden en infectie te induceren¹⁵. De fagocytose- en klaringstest wordt gebruikt om de immuunrespons tegen ziekteverwekkers te evalueren en om de microbiële strategieën te identificeren die worden gebruikt om het aangeboren immuunsysteem te omzeilen 15,16,17. Dit type techniek kan ook worden gebruikt om de differentiële kinetiek van fagocytose, vertraagde fagosoomverzuring en oxidatieve uitbarsting te onderzoeken die resulteren in verminderde schimmeldoding¹⁸.

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om fagocytose, schimmeloverleving en het ontwijken van het fagosoomrijpingsproces te evalueren. Deze omvatten fluorescentiemicroscopie, die wordt gebruikt om fagocytose, de cellulaire locatie en de moleculen die tijdens fagocytose worden geproduceerd te observeren¹⁹; flowcytometrie, die kwantitatieve gegevens over fagocytose oplevert en wordt gebruikt om de verschillende markers die bij het proces betrokken zijn te evalueren^20,21; intravitale microscopie, die wordt gebruikt om microbiële vangst en fagosoomrijping te beoordelen²²; antilichaam-gemedieerde fagocytose, die wordt gebruikt om de specificiteit van het fagocytoseproces voor een ziekteverwekker te beoordelen²³; en anderen 24,25,26,27.

Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een veelgebruikte, goedkope en directe methode met behulp van een optische microscoop en plaatgroeitest om de fagocytose en het doden van schimmelconidia te beoordelen. Dit protocol geeft de lezers stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van de fagocytose- en klaringstest met behulp van mononucleair afgeleide macrofagen uit menselijk perifeer bloed die zijn blootgesteld aan T. stromaticum. PBMC’s werden gebruikt omdat Trichoderma conidia wereldwijd worden toegepast als biologische bestrijding tegen fytopathogenen en als biomeststof voor plantaardige gewassen en verschillende menselijke infecties hebben veroorzaakt, Trichodermose genaamd. Daarnaast zijn er slechts twee eerdere werken die zich richten op de interactie tussen Trichoderma conidia en het menselijke immuunsysteem, waarin we neutrofielen²⁸ en autofagie in macrofagen²⁹ hebben onderzocht. Dit artikel laat eerst zien hoe de fagocytose van de conidia van T. stromaticum door PBMC-afgeleide macrofagen kan worden bestudeerd, en vervolgens hoe de levensvatbaarheid van de verzwolgen conidia kan worden beoordeeld met behulp van eenvoudige microscopie-gebaseerde technieken. Dit protocol kan verder onderzoek vergemakkelijken naar macrofaag-geassocieerde immuunrespons of immuunsysteemmodulatie-gerelateerde mechanismen.

Protocol

Ethische overwegingen en menselijke subjectenAlle experimenten met mensen die in deze studie worden beschreven, werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en de Braziliaanse federale wetten en goedgekeurd door de ethische commissie van de Staatsuniversiteit van Santa Cruz (projectidentificatiecode: 550.382/ 2014). Menselijk perifeer bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers uit de stad Ilhéus, Bahia, Brazilië, die niet werden blootgesteld aan beroepsactivi…

Representative Results

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. We gebruikten de fagocytose van T. stromaticum conidia om de levensvatbaarheid van de conidia na fagocytose te beoordelen, aangezien het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen mechanismen zijn van schimmelvirulentie. Onderzoekers zouden deze technieken moeten uitvoeren als een van de eerste tests bij het onderzo…

Discussion

Voor verschillende schimmelpathogenen, waaronder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans en anderen, is conidiale of gistfagocytose een sleutelproces dat het onderzoek mogelijk maakt van de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen in macrofaag-pathogene interacties, evenals voor de bepaling van het tijdstip van overlijden van de geïnternaliseerde conidia 14,39,40. Fagocytose is het…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.