Profilage génétique et criblage de décrochage à l’échelle du génome pour identifier des cibles thérapeutiques dans des modèles murins de tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique

Summary

Nous avons développé une approche d’oncogénomique comparative inter-espèces utilisant des analyses génomiques et des criblages génomiques fonctionnels pour identifier et comparer des cibles thérapeutiques dans les tumeurs apparaissant dans des modèles murins génétiquement modifiés et le type de tumeur humaine correspondant.

Abstract

Les tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques (MPNST) sont dérivées de cellules de Schwann ou de leurs précurseurs. Chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1), les MPNST sont la tumeur maligne la plus fréquente et la principale cause de décès. Ces sarcomes des tissus mous, rares et agressifs, offrent un avenir radieux, avec des taux de survie sans maladie à 5 ans de 34 à 60 %. Les options de traitement pour les personnes atteintes de MPNST sont décevantes et limitées, la chirurgie défigurante étant la principale option de traitement. De nombreuses thérapies autrefois prometteuses telles que le tipifarnib, un inhibiteur de la signalisation Ras, ont échoué cliniquement. De même, les essais cliniques de phase II avec l’erlotinib, qui cible le facteur de croissance épidermique (EFGR), et le sorafénib, qui cible le récepteur du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), et le Raf, en association avec la chimiothérapie standard, n’ont pas non plus réussi à produire de réponse chez les patients.

Au cours des dernières années, les méthodes de criblage génomique fonctionnel combinées au profilage génétique des lignées cellulaires cancéreuses se sont avérées utiles pour identifier les voies de signalisation cytoplasmique essentielles et le développement de thérapies spécifiques à la cible. Dans le cas des types de tumeurs rares, une variante de cette approche connue sous le nom d’oncogénomique comparative inter-espèces est de plus en plus utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le cadre de l’oncogénomique comparative inter-espèces, le profilage génétique et la génomique fonctionnelle sont effectués dans des modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) et les résultats sont ensuite validés dans les rares spécimens humains et lignées cellulaires disponibles.

Cet article décrit comment identifier les mutations des gènes moteurs candidats dans les cellules MPNST humaines et murines à l’aide du séquençage de l’exome entier (WES). Nous décrivons ensuite comment effectuer des criblages d’ARNsh à l’échelle du génome pour identifier et comparer les voies de signalisation critiques dans les cellules MPNST de souris et humaines et identifier des cibles médicamenteuses dans ces voies. Ces méthodologies fournissent une approche efficace pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans une variété de types de cancer humain.

Introduction

Les tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques (MPNST) sont des néoplasmes fusiformes très agressifs qui surviennent en association avec le syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1), sporadiquement dans la population générale et aux sites de radiothérapie antérieure ^1,2,3. Les patients atteints de NF1 naissent avec une copie de type sauvage du gène suppresseur de tumeur NF1 et un deuxième allèle NF1 avec une mutation de perte de fonction. Cet état d’haploinsuffisance rend les patients atteints de NF1 sensibles à une deuxième mutation de perte de fonction dans leur gène NF1 de type sauvage, qui déclenche la tumorigenèse. Lorsque cette mutation NF1 « second coup » se produit dans une cellule de la lignée cellulaire de Schwann, la tumeur qui en résulte est soit un neurofibrome dermique apparaissant dans la peau, soit un neurofibrome plexiforme qui se développe dans les gros nerfs ou les plexus nerveux. Bien que la pathologie des neurofibromes dermiques et plexiformes soit identique, leur comportement biologique est très différent – bien que les neurofibromes dermiques et plexiformes soient bénins, seuls les neurofibromes plexiformes peuvent subir une transformation et donner lieu à des MPNST. En plus de la perte de la neurofibromine, la protéine activatrice de la GTPase Ras codée par le gène NF1, les MPNST portent des mutations de plusieurs autres gènes suppresseurs de tumeurs, notamment TP53 ^4,5,6,7, CDKN2A^8,9 et PTEN 10, des mutations de gènes codant pour des composants du complexe répressif polycomb 2 ^11,12 ( ^PRC2 ; le SUZ12 et les gènes EED) et l’expression aberrante des récepteurs tyrosine kinases ^1,2. Des mutations de NF1 et des autres gènes mentionnés ci-dessus sont également présentes dans les MPNST sporadiques et radio-induites^11,12.

Bien que ces progrès dans notre compréhension des anomalies génomiques dans les MPNST aient été inestimables pour comprendre leur pathogenèse, ils n’ont pas encore abouti à la mise au point de nouvelles thérapies efficaces pour les MPNST. L’un des principaux obstacles à la mise au point de nouveaux traitements est le fait que les MPNST sont des cancers rares. Pour cette raison, il est difficile d’obtenir le grand nombre d’échantillons de patients nécessaires pour les analyses globales définissant les mutations clés telles que celles entreprises par l’Atlas du génome du cancer (TCGA). D’après notre expérience, l’accumulation d’un nombre même modeste de spécimens humains de MPNST peut prendre des années. Pour surmonter ces limitations, de nombreux chercheurs qui étudient d’autres types de cancers rares se sont tournés vers l’utilisation de l’oncogénomique comparative inter-espèces pour identifier les mutations génétiques essentielles des gènes, définir les voies de signalisation cytoplasmique essentielles dans leur tumeur d’intérêt et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Étant donné que les voies de signalisation essentielles à la tumorigenèse sont hautement conservées entre les humains et les autres espèces de vertébrés, l’application d’approches de génomique fonctionnelle telles que les criblages d’ARNsh à l’échelle du génome peut être un moyen efficace d’identifier ces nouvelles mutations pilotes, voies de signalisation et cibles thérapeutiques 13,14,15,16,17,18,19 , en particulier lors de l’étude de types de tumeurs humaines rares qui sont disponibles en nombre limité²⁰.

Dans les méthodologies présentées ici, nous décrivons cette approche pour effectuer le profilage génomique dans les lignées cellulaires MPNST humaines et les cultures MPNST à passage précoce dérivées de souris P 0-GGFβ3, un modèle murin génétiquement modifié (GEM) dans lequel la surexpression spécifique des cellules de Schwann du facteur de croissance neuréguline-1 (NRG1) favorise la pathogenèse des neurofibromes plexiformes et leur progression ultérieure vers les MPNSTs^{21, 22 et 23}. La première étape de cette approche consiste à identifier les gènes pilotes candidats dans les MPNST P 0-GGFβ3, les lignées cellulaires humaines MPNST et les MPNST humains réséqués chirurgicalement. Pour valider fonctionnellement les voies de signalisation affectées par ces mutations, nous utilisons ensuite des criblages d’ARNsh à l’échelle du génome pour identifier les gènes nécessaires à la prolifération et à la survie dans les lignées cellulaires MPNST humaines et murines. Après avoir identifié les gènes nécessaires à la prolifération et à la survie, nous identifions les produits géniques médicamenteux dans la collection de « résultats » à l’aide de la base de données sur les interactions géniques médicamenteuses. Nous comparons également les « hits » dans les cellules MPNST humaines et murines, afin de déterminer si le modèle GEM et les MPNST humains présentent une dépendance similaire aux mêmes gènes et voies de signalisation. L’identification des chevauchements dans les gènes nécessaires à la prolifération et à la survie et dans les voies de signalisation affectées permet de valider le modèle murin P 0-GGFβ3 au niveau moléculaire. Cette approche met également l’accent sur l’efficacité de la combinaison des cribles humains et murins pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, où le modèle murin peut servir de complément aux cribles humains. La valeur de cette approche inter-espèces est particulièrement évidente lorsqu’il s’agit de rechercher des cibles thérapeutiques dans les tumeurs rares, où les tumeurs humaines et les lignées cellulaires sont difficiles à obtenir.

Protocol

Avant le début des études, faire examiner et approuver les procédures et les protocoles de manipulation des vecteurs viraux sur les animaux par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) et le Comité de biosécurité institutionnel (IBC). Les procédures décrites ici ont été approuvées par les conseils d’administration de l’IACUC et de l’IBC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par un personnel correctement formé conformément au Guide…

Representative Results

Les graphiques de la figure 5 montrent les scores d’appauvrissement des gènes essentiels de base (CEG) étiquetés comme VRAI par rapport aux non-CEG (étiquetés comme FAUX) dans chaque lignée cellulaire humaine qui a été criblée. Les points représentent log2 des scores d’épuisement des plis pour les gènes individuels, qui sont tracés sur une représentation en boîte à moustaches de la distribution globale des scores. Le test t de Student a été utilisé pour tester…

Discussion

Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées pour étudier la néoplasie du système nerveux périphérique et la pathogenèse MPNST. Bien que nous ayons trouvé ces méthodes efficaces, il faut reconnaître qu’il existe certaines limites potentielles aux méthodes que nous décrivons ici. Ci-dessous, nous discutons de certaines de ces limitations et des stratégies potentielles pour les surmonter dans d’autres systèmes de modèles.

Nous avons constaté que le séqu…

Materials

Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org