RGBradford: Eiwitkwantificering met een smartphonecamera

Summary

Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de Bradford-test en een smartphone als analytisch apparaat. Eiwitniveaus in monsters kunnen worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.

Abstract

Eiwitkwantificering is een essentiële procedure in biowetenschappelijk onderzoek. Van de verschillende andere methoden is de Bradford-test een van de meest gebruikte. Vanwege de wijdverbreide verspreiding zijn de beperkingen en voordelen van de Bradford-test uitputtend gerapporteerd, inclusief verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke methode om de prestaties te verbeteren. Een van de wijzigingen ten opzichte van de oorspronkelijke methode is het gebruik van een smartphonecamera als analytisch instrument. Door gebruik te maken van de drie vormen van de Coomassie Brilliant Blue-kleurstof die bestaan in de omstandigheden van de Bradford-test, beschrijft dit artikel hoe eiwit in monsters nauwkeurig kan worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een enkele afbeelding van een microplaat. Na het uitvoeren van de test in een microtiterplaat, wordt een foto gemaakt met behulp van een smartphonecamera en worden RGB-kleurgegevens uit de foto geëxtraheerd met behulp van een gratis en open-source softwaretoepassing voor beeldanalyse. Vervolgens wordt de verhouding tussen blauwe en groene intensiteit (in de RGB-schaal) van monsters met onbekende eiwitconcentraties gebruikt om het eiwitgehalte te berekenen op basis van een standaardcurve. Er wordt geen significant verschil waargenomen tussen waarden die zijn berekend met behulp van RGB-kleurgegevens en waarden die zijn berekend met conventionele absorptiegegevens.

Introduction

Ongeacht het stroomafwaartse gebruik (bijv. ELISA, enzymkinetiek, western blotting, eiwitzuivering en massaspectrometrie), is eiwitkwantificering cruciaal voor nauwkeurige analyse in biowetenschappelijke laboratoria. Naast het gebruik ervan als secundaire uitlezingen (d.w.z. om de relatieve niveaus van analyten per massa eiwit te berekenen), kunnen eiwitniveaus in een monster ook de gewenste output zelf zijn. Men kan bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het eiwitgehalte in voedselbronnen¹ of in urine². Er zijn veel methoden beschikbaar om de eiwitconcentratie in monsters³ te meten, waaronder directe UV-absorptiemetingen⁴, eiwit-koperchelatie ^5,6, eiwit-kleurstofbindende colorimetrische assays⁷ en eiwit-kleurstofbindende fluorescerende assays⁸. De relevantie van eiwitkwantificering blijkt uit de aanwezigheid van twee artikelen die eiwitmeetmethoden^{beschrijven 5,7} in de top-3 van de meest geciteerde literatuur ^9,10. Ondanks het feit dat veel auteurs hun eigenlijke citaat verwaarlozen door niet-primaire referenties te citeren of helemaal niets te citeren, bedragen de originele artikelen die de Lowry-eiwittest en de Bradford-eiwittest beschrijven elk > 200.000 citaties^.

De populariteit van de Bradford-test komt voort uit de betaalbaarheid, eenvoud, snelheid en gevoeligheid. De test is gebaseerd op de interactie tussen eiwitten en de kleurstof Coomassie Brilliant Blue G onder zure omstandigheden. Onder de omstandigheden van de test (d.w.z. lage pH) bestaat de kleurstof in drie vormen: een rode kationische vorm met λmax bij 470 nm; een groene neutrale vorm met λmax bij 650 nm; en een blauwe anionische vorm met λmax bij 590 nm^11,12 (Figuur 1). De kationische vorm overheerst bij afwezigheid van eiwitten. Terwijl eiwitten interageren met de kleurstof, stabiliseren ze de blauwe anionische vorm, waardoor een merkbare verandering in de kleur van de oplossing ontstaat, van bruinachtig naar blauw. Gewoonlijk wordt de verandering in de concentratie van de blauwe vorm van de kleurstof spectrofotometrisch gekwantificeerd, waarvan de absorptie bij 590-595 nm evenredig is met de hoeveelheid eiwit in de test.

Figuur 1: Coomassie briljantblauwe G-absorptiespectra onder de omstandigheden van de Bradford-test. De drie hoofdpieken zijn gemarkeerd met pijlen die de λmax aangeven van de rode (470 nm), groene (650 nm) en blauwe (590 nm) vormen van de kleurstof. Spectra werden geregistreerd in afwezigheid van eiwit (gele lijn) en in aanwezigheid van 3 μg (grijze lijn) en 10 μg (blauwe lijn) runderserumalbumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het wijdverbreide gebruik van de Bradford-test heeft geleid tot de identificatie van verschillende beperkingen (bijv. variabele reacties op verschillende eiwitten¹¹ en interferentie door lipiden¹³ en wasmiddelen⁷) en de ontwikkeling van modificaties om de prestaties ervan te verbeteren (bijv. de toevoeging van wasmiddelen^14,15, alkalinisatie^14,16 en gebruik van de verhouding van absorptie¹⁷). Naast aanpassingen in de test zelf, is ook het gebruik van alternatieve apparaten, zoals smartphones of camera’s, om analytische signalen op te vangen beschreven 18,19,20. De ontwikkeling van methoden die gebruik maken van smartphones als draagbare chemische analysatoren is inderdaad een actief onderzoeksgebied geweest. De motivatie voor het gebruik van smartphones komt voort uit de betaalbaarheid, draagbaarheid, gebruiksgemak en wijdverbreide beschikbaarheid van deze apparaten.

Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de RGBradford-assay²⁰, die een smartphone als analytisch apparaat gebruikt. In tegenstelling tot de originele RGBradford-publicatie²⁰ is hier een procedure geïntroduceerd die het kleurextractieproces stroomlijnt. Het omvat het gebruik van een vrij beschikbare softwaretoepassing om automatisch kleurinformatie uit elk putje van een microplaatafbeelding te extraheren, wat veel tijd en moeite bespaart. Dit is een alternatief voor de vorige methode om handmatig één voor één kleurgegevens uit elk putje te verkrijgen met behulp van een softwaretoepassing voor grafische editor²⁰. Uiteindelijk kunnen eiwitniveaus in monsters worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.

Protocol

1. Bereiding van het Bradford-eiwittestreagens Los 100 mg Coomassie Brilliant Blue G op in 50 ml 95% (w/v) ethanol. Mix tot Coomassie Brilliant Blue G volledig is opgelost.LET OP: Ethanol is ontvlambaar en veroorzaakt oogirritatie. Vermijd vlammen en gebruik een veiligheidsbril. Voeg aan de vorige oplossing voorzichtig 100 ml fosforzuur van 85% (m/v) toe.LET OP: Fosforzuur is corrosief voor metalen en veroorzaakt huidcorrosie, ernstig oogletsel en acute orale toxiciteit. Draag…

Representative Results

Figuur 4 is een afbeelding van een microplaat waaruit kleurgegevens werden geëxtraheerd en absorptie bij 450 nm en 590 nm werd geregistreerd. De RGB-kleurgegevens die hier als representatief worden gerapporteerd, zijn automatisch verkregen zoals beschreven in sectie 5. Een typisch patroon van kleurgegevens is een toename van de blauwe waarden en een afname van de rode en groene waarden (Figuur 5). Merk op dat ondanks de duidelijke reflectie in alle putjes en ee…

Discussion

Dit artikel beschrijft RGBradford, een methode die een smartphonecamera gebruikt om gegevens van een Bradford-eiwittest vast te leggen, kleurgegevens te extraheren en eiwitniveaus in biologische monsters nauwkeurig te kwantificeren, zoals oorspronkelijk onlangs beschreven²⁰. Een verschil met de originele RGBradford-methode is dat hier een procedure werd gebruikt voor het automatisch verkrijgen van kleurgegevens met een ImageJ-plug-in²² . De belangrijkste nieuwigheid van de …

Materials

96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.