RGBradford: quantificazione delle proteine con la fotocamera di uno smartphone

Summary

Questo documento fornisce un protocollo per la quantificazione delle proteine utilizzando il saggio di Bradford e uno smartphone come dispositivo analitico. I livelli di proteine nei campioni possono essere quantificati utilizzando i dati a colori estratti da un’immagine di una micropiastra scattata con uno smartphone.

Abstract

La quantificazione delle proteine è una procedura essenziale nella ricerca nel campo delle scienze della vita. Tra i molti altri metodi, il test di Bradford è uno dei più utilizzati. A causa della sua diffusione, i limiti e i vantaggi del test di Bradford sono stati riportati in modo esaustivo, comprese diverse modifiche al metodo originale per migliorarne le prestazioni. Una delle modifiche del metodo originale è l’uso della fotocamera di uno smartphone come strumento analitico. Sfruttando le tre forme del colorante Coomassie Brilliant Blue che esistono nelle condizioni del saggio di Bradford, questo documento descrive come quantificare con precisione le proteine nei campioni utilizzando i dati cromatici estratti da una singola immagine di una micropiastra. Dopo aver eseguito il test in una micropiastra, viene scattata un’immagine utilizzando la fotocamera di uno smartphone e i dati di colore RGB vengono estratti dall’immagine utilizzando un’applicazione software di analisi delle immagini gratuita e open-source. Quindi, il rapporto tra l’intensità blu e verde (nella scala RGB) di campioni con concentrazioni sconosciute di proteine viene utilizzato per calcolare il contenuto proteico in base a una curva standard. Non si osserva alcuna differenza significativa tra i valori calcolati utilizzando i dati di colore RGB e quelli calcolati utilizzando i dati di assorbanza convenzionali.

Introduction

Indipendentemente dall’uso a valle (ad esempio, ELISA, cinetica enzimatica, western blotting, purificazione delle proteine e spettrometria di massa), la quantificazione delle proteine è fondamentale per un’analisi accurata nei laboratori di scienze biologiche. Oltre al loro utilizzo come letture secondarie (ad esempio, per calcolare i livelli relativi di analiti per massa di proteine), i livelli di proteine in un campione possono anche essere l’output desiderato. Ad esempio, si può essere interessati ai livelli di proteine nelle risorse alimentari¹ o nelle urine². Sono disponibili molti metodi per misurare la concentrazione di proteine nei campioni³, tra cui le letture dirette dell’assorbanza UV⁴, la chelazione proteina-rame ^5,6, i saggi colorimetrici di legame proteina-colorante⁷ e i saggi fluorescenti di legame proteina-colorante⁸. L’importanza della quantificazione delle proteine è evidenziata dalla presenza di due articoli che descrivono i metodi di misurazione delle proteine ^5,7 nella top-3 della letteratura più citata ^9,10. Nonostante il fatto che molti autori trascurino la loro citazione effettiva citando riferimenti non primari o non citando nulla, gli articoli originali che descrivono il saggio della proteina di Lowry e il saggio della proteina di Bradford ammontano > 200.000 citazioni ciascuno¹⁰.

La popolarità del test di Bradford deriva dalla sua convenienza, semplicità, velocità e sensibilità. Il test si basa sull’interazione tra le proteine e il colorante Coomassie Brilliant Blue G in condizioni acide. Nelle condizioni del saggio (cioè pH basso), il colorante esiste in tre forme: una forma cationica rossa con λmax a 470 nm; una forma neutra verde con λmax a 650 nm; e una forma anionica blu con λmax a 590 nm^11,12 (Figura 1). La forma cationica predomina in assenza di proteine. Quando le proteine interagiscono con il colorante, stabilizzano la forma anionica blu, causando un notevole cambiamento nel colore della soluzione, da brunastro a blu. Di solito, la variazione della concentrazione della forma blu del colorante viene quantificata spettrofotometricamente, la cui assorbanza a 590-595 nm è proporzionale alla quantità di proteina nel saggio.

Figura 1: Spettri di assorbimento G blu brillante di Coomassie nelle condizioni del saggio di Bradford. I tre picchi principali sono contrassegnati da frecce che indicano il λmax delle forme rossa (470 nm), verde (650 nm) e blu (590 nm) del colorante. Gli spettri sono stati registrati in assenza di proteine (linea gialla) e in presenza di 3 μg (linea grigia) e 10 μg (linea blu) di albumina sierica bovina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L’uso diffuso del saggio di Bradford ha portato all’identificazione di diverse limitazioni (ad esempio, risposte variabili a diverse proteine¹¹ e interferenza da parte di lipidi¹³ e detergenti⁷) e allo sviluppo di modifiche per migliorarne le prestazioni (ad esempio, l’aggiunta di detergenti^14,15, l’alcalinizzazione^14,16 e l’uso del rapporto di assorbanza¹⁷). Oltre alle modifiche nel saggio stesso, è stato descritto anche l’uso di dispositivi alternativi, come smartphone o fotocamere, per catturare i segnali analitici 18,19,20. In effetti, lo sviluppo di metodi che utilizzano gli smartphone come analizzatori chimici portatili è stata un’area di ricerca attiva. La motivazione per l’uso degli smartphone deriva dall’accessibilità, dalla portabilità, dalla facilità d’uso e dall’ampia disponibilità di questi dispositivi.

Questo documento fornisce un protocollo per la quantificazione delle proteine utilizzando il saggio RGBradford²⁰, che utilizza uno smartphone come dispositivo analitico. A differenza della pubblicazione originale^{RGBradford 20}, qui è stata introdotta una procedura che semplifica il processo di estrazione del colore. Comporta l’utilizzo di un’applicazione software disponibile gratuitamente per estrarre automaticamente le informazioni sul colore da ciascun pozzetto di un’immagine per micropiastre, risparmiando tempo e fatica significativi. Si tratta di un’alternativa al metodo precedente di acquisizione manuale dei dati di colore da ciascun pozzetto uno per uno utilizzando un’applicazione software di editor grafico²⁰. In definitiva, i livelli di proteine nei campioni possono essere quantificati utilizzando i dati a colori estratti da un’immagine di una micropiastra scattata con uno smartphone.

Protocol

1. Preparazione del reagente del saggio della proteina Bradford Sciogliere 100 mg di Coomassie Brilliant Blue G in 50 mL di etanolo al 95% (p/v). Mescolare fino a quando Coomassie Brilliant Blue G non si è completamente sciolto.ATTENZIONE: L’etanolo è infiammabile e provoca irritazione agli occhi. Evitare le fiamme e utilizzare gli occhiali. Alla soluzione precedente, aggiungere con cautela 100 mL di acido fosforico all’85% (p/v).ATTENZIONE: L’acido fosforico è corrosivo pe…

Representative Results

La Figura 4 è un’immagine di una micropiastra da cui sono stati estratti i dati cromatici ed è stata registrata l’assorbanza a 450 nm e 590 nm. I dati di colore RGB qui riportati come rappresentativi sono stati ottenuti automaticamente come descritto nella sezione 5. Un modello tipico dei dati di colore è un aumento dei valori del blu e una diminuzione dei valori del rosso e del verde (Figura 5). Si noti che, nonostante l’evidente riflesso in tutti i pozzetti…

Discussion

Questo documento descrive RGBradford, un metodo che utilizza la fotocamera di uno smartphone per registrare i dati di un test proteico Bradford, estrarre i dati cromatici e quantificare con precisione i livelli di proteine nei campioni biologici, come originariamente descritto di recente²⁰. Una differenza rispetto al metodo originale RGBradford è che in questo caso è stata utilizzata una procedura per ottenere automaticamente i dati di colore con un plug-in ImageJ²² . La …

Materials

96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.