Summary
Este estudo apresenta um modelo cirúrgico porcino de isquemia miocárdica crônica por estenose progressiva da artéria coronária, resultando em comprometimento da função cardíaca sem infarto. Após a isquemia, os animais são submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio sem circulação extracorpórea com colocação epicárdica de adesivo carregado de exossomos derivado de células-tronco. Essa terapia adjuvante melhora a função e a recuperação miocárdica.
Abstract
A isquemia miocárdica crônica decorrente da estenose coronariana progressiva leva ao miocárdio hibernante (HIB), definido como miocárdio que se adapta à redução da disponibilidade de oxigênio por meio da redução da atividade metabólica, prevenindo a lesão irreversível dos cardiomiócitos e o infarto. Isso é distinto do infarto do miocárdio, pois o HIB tem potencial de recuperação com revascularização. Pacientes com doença arterial coronariana (DAC) significativa experimentam isquemia crônica, o que os coloca em risco de insuficiência cardíaca e morte súbita. A intervenção cirúrgica padrão para DAC grave é a cirurgia de revascularização miocárdica (CRM), mas tem se mostrado uma terapia imperfeita, mas não existem terapias adjuvantes para recuperar miócitos adaptados à isquemia crônica. Para suprir essa lacuna, foi utilizado um modelo cirúrgico de HIB utilizando porcinos que é passível de revascularização miocárdica e mimetiza o cenário clínico. O modelo envolve duas cirurgias. A primeira operação envolve o implante de um constritor rígido de 1,5 mm na artéria descendente anterior (DAE). À medida que o animal cresce, o constritor gradualmente causa estenose significativa, resultando em redução da função sistólica regional. Quando a estenose atinge 80%, o fluxo e a função miocárdica ficam prejudicados, criando a HIB. Em seguida, é realizada uma CRM sem CEC com a artéria mamária interna esquerda (LIMA) para revascularizar a região isquêmica. O animal se recupera por um mês para permitir uma melhora miocárdica ideal antes do sacrifício. Isso permite estudos fisiológicos e teciduais de diferentes grupos de tratamento. Esse modelo animal demonstra que a função cardíaca permanece comprometida apesar da CRM, sugerindo a necessidade de novas intervenções adjuvantes. Neste estudo, foi desenvolvido um adesivo de colágeno embutido em exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (CTM), que pode ser aplicado cirurgicamente na superfície epicárdica distal à anastomose com LIMA. O material está em conformidade com o epicárdio, é absorvível e fornece o arcabouço para a liberação sustentada de fatores de sinalização. Essa terapia regenerativa pode estimular a recuperação miocárdica que não responde apenas à revascularização. Esse modelo se traduz na área clínica, fornecendo meios de exploração fisiológica e mecanicista sobre a recuperação em HIB.
Introduction
Globalmente, a DAC grave afeta mais de cem milhões de pacientes e, embora a taxa de mortalidade tenha diminuído, continua sendo uma das principais causas de morte 1,2. A DAC tem um amplo espectro clínico, desde infarto do miocárdio (IAM) até isquemia com viabilidade preservada. A maioria das pesquisas pré-clínicas concentra-se na IM, caracterizada pela presença de tecido infartado, pois é possível estudar em modelos animais de pequeno e grande porte. Entretanto, esse modelo não contempla pacientes com viabilidade preservada e passíveis de revascularização. A maioria dos pacientes submetidos à CRM apresenta suprimento sanguíneo diminuído e função limitada, mantendo variabilidade na reserva contrátil e viabilidade3. Sem tratamento, esses pacientes podem evoluir para insuficiência cardíaca avançada e morte súbita, especialmente durante o aumento da carga de trabalho4. Dentre esses pacientes, a cirurgia de revascularização miocárdica (CRM) é uma terapia eficaz, mas pode não resultar em recuperação funcionalcompleta5. É importante ressaltar que a disfunção diastólica, que é um marcador de piores desfechos clínicos, não se recupera após a revascularização, sugerindo a necessidade de novas terapias adjuvantes durante aCRM6,7. Atualmente, não há intervenções adjuvantes clinicamente disponíveis para a revascularização do miocárdio para restaurar a plena capacidade funcional dos cardiomiócitos. Essa é uma grande lacuna terapêutica, uma vez que muitos pacientes evoluem para insuficiência cardíaca avançada apesar da revascularizaçãoadequada8.
Foi criado um modelo porcino inovador de isquemia miocárdica crônica, passível de CRM, para mimetizar a experiência clínica de DAC9. Os suínos fornecem um bom modelo de cardiopatia em relação a outros animais de grande porte, pois não possuem colaterais epicárdicas em ponte, de modo que a estenose isolada da DAE resulta em isquemia regional10. Neste estudo, foram utilizadas porcas Yorkshire-Landrace, fêmeas com 16 semanas de idade. Nesse modelo, a DAE foi revascularizada com revascularização do miocárdio sem circulação extracorpórea com enxerto de artéria mamária interna esquerda (LIMA) (Tabela 1 Suplementar). A intervenção coronária percutânea (ICP) não é possível para abrir a estenose, pois o constritor é um dispositivo rígido. A ressonância magnética (RM) cardíaca é usada para avaliar a função global e regional, a anatomia coronariana e a viabilidade tecidual. A análise da RMC mostrou função diastólica, caracterizada pela taxa de enchimento de pico (RFP), que permanece comprometida apesar daCRM6. O mecanismo de disfunção diastólica provavelmente está relacionado ao comprometimento da bioenergética mitocondrial e da formação de colágeno no HIB que persistem após a CRM11.
As células-tronco mesenquimais (CTM) fornecem sinalização terapêutica através de exossomos para melhorar a recuperação miocárdica quando aplicadas durante a CRM. Neste modelo suíno e em estudos paralelos in vitro , demonstrou-se que a colocação de um adesivo epicárdico de vicryl MSC durante a CRM recupera a função contrátil com aumento de proteínas-chave mitocondriais, a saber, PGC-1α12, um importante regulador do metabolismo energético mitocondrial13. O modelo in vitro permitiu investigar o mecanismo de sinalização das CTMs sobre a função mitocondrial prejudicada. Exossomos são microvesículas estáveis secretadas (50-150 nm) que contêm proteínas ou ácidos nucléicos, incluindo microRNA (miRNA)14. Dados recentes in vitro sugerem que os exossomos derivados das CTM são um importante mecanismo de sinalização necessário para a recuperação da respiração mitocondrial.
Exossomos derivados de células-tronco são terapêuticas adjuvantes promissoras, pois são facilmente acessíveis, podem ser produzidos comercialmente e carecem de conflitos éticos. Em consideração à tradução clínica, foi criado um adesivo de colágeno embutido com exossomos derivados de CTM que pode ser suturado cirurgicamente à região hibernante do miocárdio. Demonstrou-se que há liberação sustentada de exossomos usando esse adesivo e ele fornece uma terapia regenerativa livre de células com mecanismo de sinalização parácrina que visa a recuperação mitocondrial e aumenta a biogênese mitocondrial15. Esse procedimento fornece o modelo pré-clínico para estudar o impacto das terapias derivadas das CTM na melhora da função cardíaca por meio do aumento da função mitocondrial e da redução da inflamação no momento da revascularização e da reversão das adaptações dos miócitos à isquemia crônica.
Neste estudo, um método cirúrgico de revascularização miocárdica sem CEC usando LIMA para anastomose da DAE para contornar a área de estenose proximal da DAE mimetizando o tratamento padrão para pacientes com DAC é mostrado. Como terapia adjuvante com CRM, foi demonstrada a aplicação cirúrgica de adesivo de colágeno embutido no exossomo derivado das CTM na região isquêmica do miocárdio. Este modelo cirúrgico pode ser utilizado para estudar as respostas fisiológicas ao efeito parácrino observado com o uso de um remendo exossômico, bem como os mecanismos moleculares de recuperação.
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Protocol
Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Minneapolis VA Medical Center e da Universidade de Minnesota aprovaram todos os estudos com animais. As diretrizes atuais do National Institutes of Health (NIH) para o uso e cuidados com animais de laboratório foram seguidas.
1. Isolamento de células-tronco mesenquimais e preparação e caracterização de exossomos
- Isolamento de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas da medula óssea
- Obter 30-50 mL de medula óssea estéril do esterno ou tíbia de uma fêmea suína Yorkshire-Landrace de 20 semanas de idade. Para isso, introduza uma agulha interóssea 15G de 25 mm no esterno ou na tíbia e retire a amostra em uma seringa de 60 mL com 10 mL de heparina.
NOTA: Para maiores detalhes sobre a coleta de medula óssea consultar Pittenger et al., Hocum-Stone et al.12,16. - Em resumo, passar o espécime de medula óssea através de um tubo Vacutainer CPT com heparina por 30 min a 1800 x g.
- Retire a camada bufante que contém as células mononucleares e lave com a solução salina balanceada de Hank. Células mononucleares pellet por centrifugação e ressuspensão em meio de cultura (10% de soro fetal bovino [SFB]).
- Transferir as células mononucleares para frascos de cultura celular para crescimento aderente. Isolar as CTMs da fração mononuclear por sua natureza aderente.
- Lavar todas as CTMs não realizadas em até 24 h, deixando uma monocamada de CTMs no frasco de cultura de tecidos. Confirmar o fenótipo das CTM por citometria de fluxo, garantindo negatividade para CD45, um marcador hematopoiético, e positividade para CD90 e CD105, marcadores das CTMs.
- Obter 30-50 mL de medula óssea estéril do esterno ou tíbia de uma fêmea suína Yorkshire-Landrace de 20 semanas de idade. Para isso, introduza uma agulha interóssea 15G de 25 mm no esterno ou na tíbia e retire a amostra em uma seringa de 60 mL com 10 mL de heparina.
- Preparação e caracterização de exossomos de células-tronco mesenquimais suínas
- Sementes 1 x 104 cardiomiócitos de ratos H9C2 e cultura em 1x DMEM+ 10% FBS e 1x Pen/strep. Semente 2 x 104 CTMs suínas em DMEM avançado + 5% FBS e 1x Pen/strep.
- Uma vez que ambas as linhagens celulares estejam pelo menos 80% confluentes, mude o meio para H9C2 e MSC esgotados do exossomo.
- Expor os cardiomiócitos H9C2 à hipóxia leve (1% O2 por 24 h). Retirar os frascos da hipóxia após 24 h e pipetar o meio H9C2.
- Remover e eliminar o suporte MSC do balão MSC. Adicionar o meio H9C2 purificado ao balão MSC. Incubar o balão durante 6 h em condições normóxicas (5% CO2, 20% O2 e 37 °C).
- Extrair os exossomos do meio condicionado co-cultivado usando o reagente de isolamento total do exossomo seguindo as instruções do fabricante.
- Verificar a identificação de exossomos por western blot na detecção de proteínas exossômicas comuns com anticorpos contra CD-63 (1:1000)17.
- Realizar análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar os exossomos e a avaliação do tamanho das nanopartículas e sua distribuição. Para fazer isso, dissolva a proteína total (50 μg) de exossomos em 500 μL de PBS para determinar a concentração e distribuição de tamanho de exossomos usando analisador de rastreamento de nanopartículas.
- Analise os dados usando um software de rastreamento de nanopartículas.
2. Cirurgia de revascularização miocárdica sem circulação extracorpórea
- Preparo animal
- Pesar o animal (porcos Yorkshire-Landrace fêmeas de 16 semanas de idade) 3 dias antes do agendamento para a cirurgia. Jejuar o animal por 12 h antes da cirurgia enquanto tem acesso à água durante o jejum.
- Administrar buprenorfina 0,18 mg/kg por via intramuscular 2-4 h antes da cirurgia.
- Indução do animal
- Sedar o animal com injeção intramuscular de 6,6 mg/kg de tiletamina-zolazepam/xilazina.
- Aguarde 15 min para garantir a sedação adequada, avaliando o tônus mandibular seguido da colocação do cateter 22G na veia central da orelha.
NOTA: Outra veia periférica pode ser considerada (ou seja, veia cefálica) se a veia da orelha for inadequada. - Administrar pomada oftálmica topicamente em cada olho. Administrar 1-2 mg/kg de propofol por via intravenosa para induzir anestesia geral. O tônus da mandíbula reflete de forma mais confiável a profundidade da anestesia e deve ser avaliado durante todo o procedimento.
- Intubar o animal com um tubo endotraqueal de tamanho adequado.
- Cirurgia
- Faça a barba no esterno e na virilha do animal em preparação para o procedimento cirúrgico.
- Colocar ventilação mecânica em 10-15 incursões respiratórias por minuto, oxigênio 1-4 L/min e isoflurano 1,0-3,0%, conforme necessário, para manter a anestesia profunda para a cirurgia. Verifique se há reflexo ocular ou mandibular ausente para confirmar a anestesia profunda.
- Equipamento de monitorização da posição (Eletrocardiograma, CO expiradofinal 2, frequência cardíaca, saturação de oxigênio, pressão arterial e temperatura) no animal.
- Conecte o cateter intravenoso a uma bolsa de solução salina normal ou solução de ringers de lactato para administrar fluidos de manutenção continuamente.
- Preparar a pele utilizando técnica asséptica com esfoliante de iodopovidona e solução 3x para esterilidade adequada e minimizar o risco de infecção do sítio cirúrgico.
- Administrar lidocaína por via intravascular (dose de ataque de 2 mg/kg ou perfusão contínua na dose de 50 mcg/kg/min) para prevenir arritmias.
- Posicione o animal dorsalmente e esfregue com toalhas estéreis.
- Realizar o corte da artéria femoral esquerda ou direita para colocação da linha arterial pela técnica de Seldinger seguido da conexão do cateter ao transdutor para monitorização contínua da pressão arterial no momento da cirurgia.
- Use o eletrocautério monopolar para fazer uma incisão de 20 cm que se estende da fúrcula esternal proximalmente até o processo xifoide distalmente, e para incisar camadas de músculos, gordura subcutânea e tecido conjuntivo até o esterno.
- Realizar esternotomia mediana utilizando serra oscilante.
OBS: A serra padrão é evitada para esternotomia de repetição, pois acarreta maior risco de lesão miocárdica por aderências pericárdicas prévias de toracotomia esquerda realizada para colocação do constritor da ADA. - Divida a placa esternal posterior com uma tesoura. Utilizar afastador de tórax especializado para visualização adequada do mediastino.
- Dissecção as aderências usando eletrocautério monopolar ou tesoura de Metzenbaum. Dissecar cuidadosamente o músculo e a gordura periesternais para expor a artéria mamária interna esquerda (LIMA).
- Uma vez exposto lateralmente à borda esternal, separe-o suavemente da parede torácica com dissecção romba com ponta de eletrocautério. Utilizar o LIMA como enxerto esqueletizado.
- Iniciar dissecção ao nível do3º espaço intercostal. Eleve suavemente a borda esternal esquerda para uma visualização ideal.
- Use tração suave na adventícia para expor os ramos arteriais e venosos do LIMA. Clipar o lado LIMA dos ramos usando hemoclipes e cauterizar a parede torácica lateral dos ramos.
OBS: Deve-se tomar cuidado para não cauterizar o clipe no LIMA, pois isso pode causar estreitamento do conduto. - Uma vez mobilizado um segmento inicial de ATI, continuar a dissecção proximalmente em direção ao nível da veia subclávia e distalmente até a bifurcação do ATI.
- Uma vez terminada a dissecção, administrar heparina por via intravenosa na dose de 100-300 U/kg. Aguarde 3 min após a administração da heparina.
- Após 3 min, clipar a extremidade distal do LIMA, imediatamente antes do nível da bifurcação do LIMA, e dividir o conduto. Costure a extremidade distal com uma gravata de sutura de seda livre 2-0.
- Preparar a extremidade proximal para enxertia. Inspecione visualmente a qualidade do fluxo deixando o enxerto sangrar por alguns segundos.
- Aperte suavemente a extremidade distal do conduto LIMA com uma pinça de buldogue atraumática para evitar sangramento. Abrir o pericárdio com um T invertido fazendo uma incisão de aproximadamente 5-6 cm. Coloque pontos de tamanho 3-0 no pericárdio para tração em ambos os lados da fenda.
- Estabilizar a DA com fitas de retração de silicone e estabilizador tecidual, que é fixado ao afastador esternal. Fazer uma arteriotomia na artéria LAD distal à estenose (causada por banda constritora) com uma lâmina 11 e estender com uma tesoura de íris.
- Coloque um shunt coronário de tamanho adequado na DAD. Realizar a anastomose LIMA a LAD com sutura inabsorvível 7-0 utilizando técnica de bypass sem circulação extracorpórea. Solte o oclusor bulldog no LIMA e confirme a hemostasia.
- Preparação de adesivo de exossomo derivado de células-tronco mesenquimais (CTM)
- Após o isolamento bem-sucedido dos exossomos das CTMs, suspender cerca de 3 x 108 exossomos em 3 mL de solução salina normal e adicionar à esponja de colágeno.
- Levar 3 ml de suspensão do exossoma à temperatura ambiente a cerca de 22 °C durante 10 minutos. Coloque 2 esponjas de colagem absorvíveis (cada uma com 1,27 cm x 2,54 cm) em uma placa de Petri média.
- Use uma seringa de 5 mL com uma agulha 18G para misturar suavemente a suspensão do exossomo. Pipetar lentamente 1,5 mL de suspensão em cada esponja de colágeno e aguardar 5 min para absorção total.
- Colocação de adesivo exossômico
- Coloque a esponja carregada de exossomos de cabeça para baixo na região hibernante do coração, que é o epicárdio da região septal anterior na distribuição da DA.
- Coloque suavemente duas esponjas para cobrir a região de hibernação do coração. Use uma tela de poliglactina de 3,5 cm x 1,0 cm para cobrir cada esponja de colágeno.
- Costure a tela no epicárdio com finas suturas 7-0 interrompidas.
- Colocação de dreno torácico
- Colocar um dreno torácico através de uma incisão separada, próximo ao aspecto inferior da incisão da esternotomia. Coloque o dreno torácico cautelosamente sobre a face anterior do coração.
- Uma vez que o tubo está no lugar, coloque uma sutura de corda em bolsa com sutura 3-0 usando um ponto de colchão horizontal para permitir o fechamento da ferida após a remoção do tubo.
- O dreno torácico é mantido até o fechamento completo do tórax.
- Fechamento torácico
- Aproximar o esterno com pontos inabsorvíveis usando um padrão de figura oito. Administrar 1 mg/kg de bupivacaína por via intramuscular em toda a extensão da incisão.
NOTA: A sutura é usada em vez de fios para evitar interferência com imagens de ressonância magnética. - Fechar camadas de músculo e pele de forma padrão usando sutura absorvível 2-0 e 3-0, respectivamente.
- Realize uma pausa respiratória e sucção para evacuar todo o ar para fora da cavidade torácica. Monitorar a pressão das vias aéreas no ventilador com cautela e manter a pressão entre 15-22 mmHg e liberar quando completa.
- Uma vez que todo o ar é evacuado, remova o dreno torácico enquanto fecha a ferida usando a sutura de corda da bolsa. Aplicar cola adesiva topicamente para cobrir a incisão esternal.
- Aproximar o esterno com pontos inabsorvíveis usando um padrão de figura oito. Administrar 1 mg/kg de bupivacaína por via intramuscular em toda a extensão da incisão.
- Cuidados pós-operatórios no pós-operatório
- Desmame gradualmente o animal do ventilador à medida que a incisão da pele estiver sendo fechada. Certifique-se de que o animal é capaz de respirar espontaneamente e proteger os reflexos antes de desconectá-lo do equipamento de anestesia.
- Retirar o tubo endotraqueal após confirmar que o animal é capaz de proteger sua via aérea. Cobrir a incisão da pele com curativo estéril e não aderente embutido com pomada antibiótica para minimizar a infecção do sítio cirúrgico.
- Continue a monitorar os sinais vitais, incluindo frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura corporal a cada 15 minutos até que o animal seja capaz de manter sua posição sem assistência.
- Certifique-se de que o animal não seja deixado sozinho até que possa levantar e manter a cabeça erguida e possa ficar em pé sem assistência. Administrar meloxicam na dose de 0,2 mg/kg por via subcutânea antes de transportar o animal para a unidade de recuperação.
- Transporte o animal para a unidade de recuperação quando o animal estiver estável. Manter o curativo do sítio cirúrgico na incisão até o 3º dia de pós-operatório. Substitua o curativo se ele ficar sujo.
- Continue a monitorar o nível da dor, incisão na pele e bem-estar geral do animal nos primeiros 5 dias após a cirurgia. Administrar meia dose de meloxicam (0,1 mg/kg) conforme necessário uma vez por dia para dor de escape.
- Um único alojamento do animal durante os primeiros 5 dias após a cirurgia enquanto a(s) incisão(s) cicatriza(m) para reduzir o risco de infecção do sítio cirúrgico por outro animal. Devolver o animal ao alojamento do grupo após 5 dias.
- Comunicar quaisquer complicações ou alterações no estado do animal (febre, ascite, perda de peso, inapetência, etc.) ao veterinário ou ao pessoal adequado.
3. Cineangiocoronariografia por acesso femoral
- Fixar o animal na mesa cirúrgica no decúbito dorsal. Iniciar a ventilação mecânica a 10-15 respirações por minuto. Colocar oxigênio em 2-4 L/min, isoflurano em 1% e 4%, conforme necessário para manter um plano profundo de anestesia.
- Coloque eletrocardiogramas no membro do animal para monitorar o ritmo cardíaco. Avaliar o animal quanto à profundidade da anestesia. Considere o animal profundamente anestesiado quando o reflexo ocular ou mandibular estiver ausente.
- Limpe a área do peito e pescoço com esfoliação de iodopovidona e, em seguida, esfregue o animal com toalhas.
- Acessar a artéria femoral via corte cirúrgico e expor a artéria e veia femoral. Fazer uma incisão longitudinal de 1-2 mm com lâmina nº 11 na artéria femoral e canular a artéria com introdutor de 11 Fr na luz do vaso.
- Após a obtenção do acesso, adiante o cateter para realização de cineangiocoronariografia para avaliar a permeabilidade anatômica do enxerto LIMA-DAD.
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Representative Results
Após a revascularização, a cineangiocoronariografia é realizada para avaliar a estenose da DAE (maior que 80%) e a patência do enxerto LIMA-LAD (Figura 1). Quatro semanas após a cirurgia de revascularização e colocação do adesivo de colágeno carregado de exossomos, a RMC cardíaca é realizada para avaliar a função sistólica e diastólica do coração em repouso e sob estresse usando infusão de dobutamina em baixas doses a 5μg/kg/min. A função sistólica é analisada medindo-se a porcentagem da espessura da parede (espessura da parede no final da sístole - espessura da parede no final da diástole). A função diastólica é analisada medindo-se a taxa de enchimento de pico sobre o volume diastólico final (RFP/VDF; Gráfico 2). Imagens de contraste tardio foram realizadas para confirmar a ausência de infarto do miocárdio no território da DAD. Se um infarto na região da DAE estiver presente, é provável que seja devido à artéria ocluída secundária à trombose causada pelo constritor. A ausência de anormalidades da motilidade segmentar regional demonstra ausência de fenótipo hibernante.
Com baixas doses de infusão de dobutamina, os animais HIB demonstraram diminuição significativa da função diastólica, medida por RFP/VDF, em comparação com o grupo controle (5,5 ± 0,8 vs. 6,9 ± 1,5, respectivamente, p < 0,05). O grupo CRM demonstra uma tendência à melhora da RFP/VDF em relação ao grupo HIB (6,3 ± 0,9 vs. 5,5 ± 0,8, respectivamente, p = 0,06). Entretanto, os grupos CRM + CTM demonstram um aumento significativo na RFP/VDF quando comparados ao grupo HIB (6,6 ± 1,1 vs. 5,5± 0,8, respectivamente, p = 0,03; Gráfico 3). A RMC foi utilizada para confirmar a ausência de necrose e perviedade da artéria mamária interna esquerda (LIMA) para a artéria descendente anterior (DA) na cirurgia de revascularização distal à área de estenose18.
Em repouso, o grupo CRM + CTM não altera a função sistólica regional (medida pela espessura percentual da parede) em comparação com a CRM isolada (26,3% ± 7,0% vs. 34,9% ± 6,3%; p = 0,19). Sob estresse, o grupo CRM + CTM apresenta melhora significativa da função sistólica regional em comparação com a CRM isolada (78,3% ± 19,6% vs. 39,2% ± 5,6%; p = 0,05)12 (Figura 4).
Na necropsia, dilatadores coronarianos de tamanho adequado foram usados para garantir a estenose da DAE e a perviedade da ATI. O miocárdio foi grosseiramente inspecionado para garantir a viabilidade tecidual em todas as regiões, especialmente na região isquêmica. A coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) confirmou ausência de cicatriz.
Gráfico 1. Angiografia cardíaca demonstrando a anatomia. A cineangiocoronariografia demonstra estenose de >80% da artéria DA proximal e anastomose do enxerto LIMA-LAD. Abreviações: LIMA= Artéria mamária interna esquerda, LAD= Descendente anterior esquerda Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Avaliação do relaxamento diastólico, função contrátil global e viabilidade por RMC. (A) Relaxamento diastólico: relação do volume do ventrículo esquerdo (VE) durante um ciclo cardíaco. O eixo x é o tempo em s; eixo y é o volume do ventrículo esquerdo em mL. A linha vermelha indica a taxa de enchimento de pico (taxa mais rápida na qual o VE aumenta o volume). A RFP é normalizada para o volume diastólico final do animal (RFP/VDF) para explicar a variação de tamanho entre os animais. (B) Função contrátil global: Tensão circunferencial segmentar (Circ strain) durante o ciclo cardíaco (eixo x: tempo em ms; eixo y: mudança percentual no comprimento circunferencial do segmento ventricular esquerdo em comparação com a medida diastólica final). O pico de deformação circunferencial é representado pelo valor mais negativo do ciclo. (C) Imagem representativa da distribuição da DA em RMC (ADA): a distribuição da DA é destacada em vermelho representando a parede ântero-septal. Não houve evidência de infarto com base no contraste gadolínio realce nas incidências de eixo longo de 4 câmaras (D) e eixo curto (E). Abreviações: VE = ventrículo esquerdo/ventricular; DAE = descendente anterior; RM= ressonância magnética. Este valor foi modificado de 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Avaliação por RM da taxa de enchimento pico/volume diastólico final. A função diastólica, medida por RFP/VDF, foi comparada entre quatro grupos (Controle, HIB, CRM e CRM + CTM). Em repouso, a RFP/VDF é comparável entre quatro grupos de animais. Entretanto, sob estresse com infusão de dobutamina em baixas doses (5μg/kg/min), o grupo HIB apresentou redução significativa da RFP/VDF quando comparado ao controle (p < 0,05), com tendência à melhora no grupo CRM (p = 0,06) e aumento significativo no grupo CRM + CTM (p < 0,05). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste de análise de variância (ANOVA) one-way. Os dados são apresentados como médias ± DP. Abreviações: CRM= Cirurgia de revascularização miocárdica, PFR= Taxa de enchimento pico, VDF= volume diastólico final; RM= Ressonância magnética, CTM= Células-tronco mesenquimais, DP= Desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Avaliação da função sistólica regional pela RM por meio do espessamento parietal. O tratamento com adesivo de CTM mostra melhora na função cardíaca regional em comparação com o adesivo simulado. (A) A função sistólica regional, medida pela porcentagem de espessamento parietal, não melhora significativamente em repouso com o tratamento com remendo de CTM (n = 6) em comparação com sham (n = 6). (B) Sob estresse com infusão de dobutamina em baixas doses (5μg/kg/min), há melhora significativa da função sistólica regional após o tratamento com o adesivo de CTM em comparação com animais sham (P<,05). as análises estatísticas foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. As barras horizontais indicam o desvio padrão médio. *P<.05. Abreviações: MSC= Células-tronco mesenquimais. Este número foi modificado de 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quadro complementar 1. Visão geral dos procedimentos e cronograma de cada procedimento. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este estudo apresenta o primeiro modelo porcino de miocárdio cronicamente isquêmico, no qual foi demonstrado que o tratamento com um adesivo carregado de colágeno carregado de exossomo derivado de CTM durante a revascularização cirúrgica recupera a função diastólica e sistólica mediante estimulação inotrópica, potencialmente visando a recuperação mitocondrial. Anteriormente, foi demonstrado que, em um modelo animal de grande porte de HIB, a função diastólica e sistólica, medida pela RMC cardíaca, permanece comprometida e melhora apenas ligeiramente com a revascularização sem recuperação completa 6,19. A disfunção ocorreu apesar da fração de ejeção do ventrículo esquerdo preservada. Esses achados mimetizam com precisão a experiência clínica observada em pacientes com miocárdio isquêmico crônico em território uniarterial com função ventricular esquerda preservada.
Existem vários desafios críticos e técnicos durante a cirurgia de revascularização, especialmente no contexto de toracotomia prévia. A lesão cardiovascular na entrada do esterno é um risco, pois o pericárdio já foi rompido e aderências podem estar presentes. A esternotomia pode causar lesão cardíaca devido à proximidade ou aderência ao esterno. Esse risco pode ser mitigado pelo uso de uma serra oscilante, que demonstrou promover uma reentrada esternal sem intercorrências.
Um aspecto fundamental para o sucesso da CRM é a qualidade do enxerto. A coleta meticulosa do LIMA é um aspecto técnico importante na realização bem-sucedida de revascularização do miocárdio de alta qualidade e está associada à melhora da patência do enxerto. O LIMA pode ser colhido por duas técnicas: pediculado e esqueletizado. A técnica pedidizada inclui a dissecção do LIMA do esterno, juntamente com suas veias, fáscia, gordura e linfáticos. A técnica esqueletizada inclui a dissecção do LIMA livre de todo o tecido circunjacente, obtendo, portanto, apenas20 artérias. Nesse modelo, a técnica de esqueletização foi implementada por ser capaz de minimizar a isquemia esternal e o enxerto ser mais longo que um LIMA pediculado20. O LIMA é uma estrutura delicada, qualquer alongamento, pinçamento ou pinça mal posicionada pode resultar em lesão vascular e resultados insatisfatórios. Durante a dissecção, a ponta do cautério deve ser usada com cautela e em baixa voltagem. Ao separar a artéria de seus ramos perfurantes, o lado LIMA dos ramos é cortado usando hemoclipes. Deve-se tomar cuidado para não cauterizar os clipes, pois isso pode resultar em estreitamento do conduto. Confirmar o fluxo pulsátil antes da enxertia.
Certifique-se de que quantidades razoáveis de anestesia e paralíticos sejam mantidas para minimizar o movimento durante a cirurgia, especialmente durante a costura da anastomose. É fundamental o uso de doses adequadas de lidocaína e heparina (200-300 unidades/kg) para eliminar o risco de arritmia e trombose, respectivamente. Uma segunda dose de lidocaína pode ser indicada se o animal apresentar arritmias durante a cirurgia. O uso de linha arterial femoral permite a monitorização hemodinâmica contínua. Ao realizar a anastomose, é útil colocar 1-2 esponjas cirúrgicas atrás do coração ou colocar suturas em ambos os lados do pericárdio para elevar o ventrículo esquerdo para cima. Neste modelo, utilizamos fitas de silastic e o estabilizador tecidual que utiliza pressão de sucção para imobilizar efetivamente o local alvo. Uma leve queda na pressão arterial, além da depressão do segmento ST no ECG, pode ser observada uma vez que o estabilizador é colocado e o coração é levantado. Esses distúrbios hemodinâmicos são geralmente bem tolerados sem a necessidade de intervenções. Em situações em que a instabilidade hemodinâmica é significativa, uma dose de fenilefrina (5-20 μg/kg) por via intravenosa pode ser administrada para elevar a pressão arterial. Se a instabilidade hemodinâmica for fatal, uma dose de epinefrina (0,1 μg/kg; diluída 1:10.000) pode ser administrada por via intravenosa como um medicamento de resgate de emergência. Uma vez que a DAE é exposta com uma lâmina de castor, uma arteriotomia é realizada com uma lâmina 11 e completada com tesoura microcirúrgica. Deve-se ter cuidado para não lesar a parede posterior da DAE durante essa manobra. É fundamental manter o local da arteriotomia incruento durante a CRM sem CEC para permitir uma sutura precisa e várias técnicas têm sido descritas, incluindo irrigação intermitente com solução salina, uso de soprador de CO2 e shunts coronarianos intraluminais21. Neste estudo, o ventilador CO2 juntamente com um shunt coronariano intraluminal de tamanho adequado foram usados, pois ambos são rotineiramente usados nas operações de revascularização miocárdica sem CEC. Uma complicação potencialmente letal do soprador de mister CO2 é uma embolia gasosa. No entanto, o risco de embolia gasosa pode ser negado com o uso do shunt coronariano, que pode atuar como uma barreira física dentro da arteriotomia. Além disso, o uso de shunt coronariano ajuda a manter o campo cirúrgico sem sangue, o que permite o uso de um menor fluxo de gás e minimiza ainda mais o risco de embolia gasosa. Os shunts também melhoram a precisão técnica da anastomose e previnem a lesão inadvertida da parede posterior da artéria durante asutura22.
Nesse modelo porcino bem estabelecido, foi empregada uma técnica sem CEC e não com CEC durante a cirurgia de revascularização miocárdica. As vantagens do uso dessa técnica, ao invés da com CEC, é minimizar o tempo operatório e evitar a canulação central da aorta e átrio direito com heparinização total. Além disso, auxilia na recuperação mais rápida do animal após a cirurgia, reduzindo o risco de sangramento pós-operatório e/ou temponade cardíaca. Essas são vantagens presumidas com base na experiência clínica em pacientes submetidos à CRM com e sem circulação extracorpórea.
Este adesivo de colágeno carregado de exossomos é novo na medida em que pode ser quantificado e fixado cirurgicamente à região de isquemia que foi revascularizada. Isso permite a liberação sustentada de exossomos do remendo ao longo de vários dias, resultando em tratamento contínuo e direto da região isquêmica. A histopatologia do tecido hibernante 4 semanas após o tratamento com revascularização miocárdica e exossomo demonstrou ausência de resposta inflamatória do miocárdio ao próprio remendo, embora alguma inflamação tenha sido observada no local das suturas, como evidente pela coloração para células inflamatórias. Embora uma variedade de métodos tenha sido sugerida para a liberação do exossomo no miocárdio, técnicas comuns, como a injeção direta do exossomo, resultam em baixa retenção do produto terapêutico na área lesada, pois até 90% dos exossomos são lavados ou dispersam após a injeção23. A análise da retenção de exossomos após a injeção foi concluída por até 3 h após a injeção e mostrou reduções significativas no conteúdo do exossomo24. Os exossomos são fáceis de isolar e têm mais flexibilidade nas condições de armazenamento por longos períodos de tempo, apresentando uma oportunidade para produtos prontos que podem ser usados no ambiente agudo, tornando-os mais traduzíveis para os pacientes.
Este estudo tem várias limitações, incluindo idade e sexo dos animais. Dadas as limitações cirúrgicas e logísticas, considerações em torno das normas de bem-estar animal e segurança do pessoal, apenas fêmeas juvenis de suínos foram estudadas. Embora a cirurgia de revascularização miocárdica aumente a complexidade do modelo, foi uma intervenção necessária, pois outras intervenções menos invasivas (intervenção coronária percutânea ou ICP) não permitiriam abrir a região estenótica da DAE devido à rigidez do constritor18. Além disso, esse modelo de estenose uniarterial sem comorbidades não simula completamente a extensão e os efeitos da aterosclerose coronariana de longa duração observada na população humana. Estudos futuros se concentrarão na utilização de um modelo de doença multiarterial de miocárdio hibernante por meio da colocação cirúrgica do constritor na artéria circunflexa e da DAE. Entretanto, esse modelo de doença biarterial resultaria em miocárdio hibernante com fração de ejeção reduzida. A mortalidade dos animais provavelmente aumentaria, e a revascularização cirúrgica é mais complexa e requer suporte com circulação extracorpórea com CEC. No futuro, se houver problemas com as aplicações práticas do tipo patch, outras opções de material de andaime serão exploradas, como matriz extracelular decelularizada ou forma alternativa de hidrogéis.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo VA Merit Review #I01 BX000760 (RFK) dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos BLR&D e Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA concedem #I01 BX004146 (TAB). Também agradecemos o apoio do Instituto do Coração Lillehei da Universidade de Minnesota. O conteúdo deste trabalho não representa a opinião do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA do Governo dos Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Ethibond | Ethicon | MG46G | Suture |
| # 40 clipper blade | Oster | 078919-016-701 | Remove hair from surgery sites |
| 0 Vicryl | Ethicon | J208H | Suture |
| 1 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1188100777 | Administer injectable agents |
| 1" medical tape | Medline | MMM15271Z | Secure wound dressing and IV catheters |
| 1000mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1324X | IV replacement fluid |
| 12 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881512878 | Administer injectable agents |
| 18 ga needles | BD | 305185 | Administration of injectable agents |
| 20 ga needles | BD | 305175 | Administration of injectable agents |
| 20 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881520657 | Administer injectable agents |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J317H | Suture |
| 250 mL 0.9% saline | Baxter | UE1322D | Replacement IV Fluid |
| 3 mL Syinge | Medtronic/Covidien | 1180300555 | Administer injectable agents |
| 3-0 Vicryl | Ethicon | VCP824G | Suture |
| 36” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX563 | Connect art. Line to transducer |
| 4.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43040 | Establish airway for Hibernation |
| 4-0 Tevdek II Strands | Deknatel | 7-922 | Suture to secure constrictor around LAD |
| 48” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX564 | Connect art. Line to transducer |
| 500mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1323Q | Drug delivery, Provide mist for Blower Mister |
| 6 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1180600777 | Administer injectable agents |
| 6.0 mm ID endotracheal tube | Mallinckrodt | 86049 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6.5 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43065 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6” pressure tubing line | Smith’s Medical | MX560 | Collect bone marrow |
| 60 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881560125 | Administer injectable agents |
| 7.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43070 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 7-0 Prolene | Ethicon | M8702 | Suture |
| Advanced DMEM (1X) | ThermoFisher Scientific | 12491023 | |
| Alcohol Prep pads | MedSource | MS-17402 | Skin disinfectant |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC910024 | |
| Anesthesia Machine | Drager | Fabious Trio | maintains general anesthesia |
| Anesthesia Machine + ventilator | DRE Drager- Fabius Tiro | DRE0603FT | Deliver Oxygen and inhalant to patient |
| Anesthesia Monitor | Phillips Intellivue | MP70 | Multiparameter for patient safety |
| Arterial Line Kit | Arrow | ASK-04510-HF | Femoral catheter for blood pressure monitoring |
| Artificial Tears | Rugby | 0536-1086-91 | Lubricate eyes to prevent corneal drying |
| Bair Hugger | 3M | Model 505 | Patient Warming system |
| Basic pack | Medline | DYNJP1000 | Sterile drapes and table cover |
| Blood Collection Tubes- green top | Fisher Scientific | 02-689-7 | Collect microsphere blood samples |
| Blower Mister Kit | Medtronic/Covidien | 22120 | Clears surgical field for vessel anastomosis |
| BODIPY TR Ceramide | ThermoFisher Scientific | D7540 | |
| Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle | Vidacare | 9001-VC-005 | Collect bone marrow |
| Bone Wax | Medline | ETHW31G | Hemostasis of cut bone |
| Bovie Cautery hand piece | Covidien | E2516 | Hemostasis |
| Bupivicaine | Pfizer | 00409-1161-01 | Local Anesthetic |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Sigma Aldrich | B9275 | Pre operative Analgesic for survivial procedures |
| Cell Scrapers | Corning | 353085 | |
| Cephazolin 1 gr | Pfizer | 00409-0805-01 | Antibiotic |
| Chest Tube | Covidien | 8888561043 | Evacuates air from chest cavity |
| Cloroprep | Becton Dickenson | 260815 | Surgical skin prep |
| CPT tube | BD | 362753 | MSC isolation from bone marrow |
| Delrin Constrictor | U of MN | Custom made | Creates stenosis of LAD |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Skin adhesive |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430062 | |
| Dobutamine 12.5 mg/mL | Pfizer | 00409-2344-01 | Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection |
| ECG Pads | DRE | 1496 | Monitor heart rhythm |
| Exosome-Depleted FBS | ThermoFisher Scientific | A2720801 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| Femoral and carotid introducer | Cordis- J&J | 504606P | femoral and carotis cannulas |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS | ThermoFisher Scientific | 16140089 | |
| Flo-thru 1.0 | Baxter | FT-12100 | used to anastomos LIMA to L |
| Flo-thru 1.25 | Baxter | FT-12125 | FT-12125 |
| Flo-thru 1.5 | Baxter | FT-12150 | FT-12150 |
| Flo-thru 2.0 | Baxter | FT-12200 | FT-12200 |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Clipper | Oster | 078566-011-002 | Remove hair from surgery sites |
| Helistat collagen sponge | McKesson | 570973 1690ZZ | Sponge for embedding exosomes |
| Heparin | Pfizer | 0409-2720-03 | anticoaggulant |
| Histology Jars | Fisher Scientific | 316-154 | Formalin for tissue samples |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Hypafix | BSN Medical | 4210 | Secure wound dressing and IV catheters |
| Isoflurane | Sigma Aldrich | CDS019936 | General Anesthestic- Inhalant |
| IV Tubing for Blower Mister | Carefusion | 42493E | Adapts to IV Fluids for Blower/Mister |
| Jelco 18 ga IV catheter | Smiths medical | 4054 | IV access in Revasc, MRI and Term |
| Lidocaine 2% | Pfizer | 00409-4277-01 | Local Anesthetic/ antiarrthymic |
| Ligaclips | Ethicon | MSC20 | Surgical Staples for LIMA takedown |
| Long blade for laryngoscope | DRE | 12521 | Allows for visualization of trachea for intubation |
| Meloxicam 5 mg/mL | Boehringer Ingelheim | 141-219 | Post operative Analgesic |
| Microsphere pump | Collect blood samples from femoral introducer | ||
| Monopolar Cautery | Covidien | Valleylab™ FT10 | Hemostasis |
| Nanosight NS 300 | Malvern Panalytical | MAN0541-03-EN | |
| NTA 3.1.54 software | Malvern Panalytical | MAN0520-01-EN-00 | |
| OPVAC Synergy II | Terumo Cardiovascular System | 401-230 | Heart positioner and Stabilizer |
| Oxygen Tank E cylinder | various | various | Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter |
| PBS, pH 7.2 | ThermoFisher Scientific | 20012050 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | ThermoFisher Scientific | 15640055 | |
| Pigtail 145 catheter 6 French | Boston Scientific | 08641-41 | Measure LV pressures |
| Pressure Transducer | various | Must adapt to anesthesia monitor | Monitor direct arterial pressures |
| Propofol | Diprivan | 269-29 | Induction agent |
| Roncuronium | Mylan | 67457-228-05 | Neuromuscular blocking agent |
| SR Buprenorphine 10 mg/mL | Abbott Labs | NADA 141-434 | Post operative Analgesic |
| Sterile Saline 20 mL | Fisher Scientific | 20T700220 | Flush for IV catheters |
| Sternal Saw/ Necropsy Saw | Thermo Fisher | 812822 | Used to open chest cavity |
| Stop Cocks | Smith Medical | MX5311L | 2 to connect to pig tail |
| Succinylcholine 20 mg/mL | Pfizer | 00409-6629-02 | Neuromuscular blocking agent |
| Suction tubing | Medline | DYND50223 | |
| Suction Container | Medline | DYNDCL03000 | |
| Surgery pack with chest retractor | various | See pack list | Femoral cut down and median sternotomy |
| Surgical Instruments | various | See pack list | Femoral and carotid cutdowns and sternotomy |
| Surgical Spring Clip | Applied Medical | A1801 | Clamp end of LIMA after takedown |
| Syringe pump | Harvard | Delivers IV Dobutamine infusion | |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Millipore Sigma | S32703 | |
| Telazol 100 mg/mL | Fort Dodge | 01L60030 | Pre operative Sedative |
| Telpha pad | Covidien | 2132 | Sterile wound dressing |
| Timer | Time collection of blood samples | ||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher Scientific | 4478359 | |
| TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE | ThermoFisher Scientific | TP90076 | |
| Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 23734 | Topical over wound |
| Vicryl mesh | Ethicon | VKML | Patch for epicardial cell application |
| Vortex | Mix microspheres | ||
| Xylazine 100 mg/mL | Vedco | 468RX | Pre operative Sedative/ analgesic |
References
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