Profilo fenotipico dei neuroni dopaminergici del mesencefalo derivati da cellule staminali umane

Summary

Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l’identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.

Abstract

Il morbo di Parkinson (PD) è legato a una serie di processi biologici cellulari che causano la perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA). Molti attuali modelli cellulari di PD in vitro mancano di complessità e non tengono conto di fenotipi multipli. Il profilo fenotipico nei neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) può affrontare queste carenze misurando simultaneamente una serie di fenotipi neuronali in un tipo di cellula rilevante per la PD in parallelo. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere e analizzare i profili fenotipici da neuroni mDA umani disponibili in commercio. Un pannello di colorazione fluorescente specifico per i neuroni viene utilizzato per visualizzare i fenotipi correlati alla proteina nucleare, alla α-sinucleina, alla tirosina idrossilasi (TH) e alla proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2). Il protocollo di profilazione fenotipica descritto è scalabile in quanto utilizza piastre a 384 pozzetti, manipolazione automatica dei liquidi e microscopia ad alto rendimento. L’utilità del protocollo è esemplificata utilizzando neuroni mDA donatori sani e neuroni mDA portatori della mutazione G2019S legata al PD nel gene della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina (LRRK2). Entrambe le linee cellulari sono state trattate con l’inibitore della chinasi LRRK2 PFE-360 e sono stati misurati i cambiamenti fenotipici. Inoltre, dimostriamo come i profili fenotipici multidimensionali possano essere analizzati utilizzando metodi di classificazione supervisionati basati sul clustering o sull’apprendimento automatico. Il protocollo descritto interesserà in particolare i ricercatori che lavorano sulla modellazione delle malattie neuronali o che studiano gli effetti dei composti chimici nei neuroni umani.

Introduction

Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l’interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD¹. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un’impronta digitale fenotipica completa o di un profilo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA).

La profilazione fenotipica è un approccio che prevede la creazione di un profilo di un campione basato su una raccolta di caratteristiche misurabili e, in secondo luogo, comporta la formulazione di previsioni su un campione basato su questo profilo ^2,3. L’obiettivo della profilazione è quello di acquisire una vasta gamma di caratteristiche, alcune delle quali potrebbero non essere state precedentemente associate a una malattia o a un trattamento³. Di conseguenza, la profilazione può rivelare processi biologici inaspettati. La profilazione fenotipica si basa tipicamente su cellule colorate con fluorescenza e saggi standardizzati, come il Cell Painting, sono stati sviluppati per creare profili fenotipici⁴. Recentemente, la profilazione fenotipica è stata, ad esempio, applicata per la caratterizzazione di piccole molecole o per la predizione accurata di sottotipi di PD basati esclusivamente su fibroblasti derivati da pazienti ^5,6. Nonostante questi progressi, il profilo fenotipico è stato raramente applicato a cellule differenziate post-mitotiche, come i neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) che esprimono mutazioni legate al PD come LRRK2 G2019S. Le sfide significative dei modelli derivati da iPSC includono la presenza di caratteristiche patologiche sottili o variabili tra i lotti di differenziazione o i genotipi e il fatto che i fenotipi isolati di PD non catturano l’intera complessità della malattia. Inoltre, mentre i modelli neuronali di iPSC sono fisiologicamente rilevanti, sono raramente utilizzati nei processi di scoperta di farmaci per la malattia di Parkinson a causa di preoccupazioni sulla complessità tecnica ^7,8.

In precedenza abbiamo sviluppato una solida metodologia per misurare più fenotipi fisiopatologici correlati al PD nei neuroni mDA umani che sono sensibili ai cambiamenti fenotipici indotti da composti genetici e chimici⁹. Questo articolo descrive in dettaglio una versione ulteriormente ottimizzata di questa metodologia per creare profili fenotipici da neuroni mDA (Figura 1). Questo protocollo presenta diversi vantaggi rispetto agli approcci di profilazione fenotipica descritti in precedenza, come l’uso di neuroni mDA di alta qualità e la riproducibilità tecnica. Per la prima volta, questo protocollo consente la profilazione fenotipica nei neuroni mDA post-mitotici fisiologicamente rilevanti dopo perturbazioni chimiche in modo altamente scalabile. I neuroni mDA completamente differenziati e crioconservati sono disponibili in commercio, riducendo significativamente la variabilità della differenziazione da lotto a lotto. In secondo luogo, la variabilità tecnica può essere ulteriormente ridotta utilizzando un disegno sperimentale ben definito (ad esempio, la durata della coltura o evitando i pozzetti di bordo), la manipolazione automatizzata dei liquidi e la microscopia automatizzata. Inoltre, le fasi iniziali dell’analisi del profilo fenotipico utilizzando approcci di clustering non supervisionato o classificazione supervisionata sono descritte qui, indicando come possono essere analizzati i dati di profilazione fenotipica. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori interessati ai cambiamenti fenotipici dei neuroni mDA indotti da perturbazioni genetiche o chimiche, in particolare quando è richiesta una configurazione di studio altamente scalabile, ad esempio durante le campagne di screening o quando gli effetti di un numero minore di composti devono essere studiati, ad esempio, per determinare gli effetti tossici. In sintesi, si prevede che l’applicazione del profilo fenotipico dei neuroni umani sia una tecnica preziosa per studiare fenotipi complessi correlati alla malattia e caratterizzare gli effetti cellulari dei farmaci candidati.

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per generare profili fenotipici basati su immagini da neuroni mDA umani derivati da iPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione del terreno e delle piastre per la semina dei neuroni (Giorno 1) Per preparare le piastre per la semina dei neuroni il giorno 1, riscaldare la laminina a temperatura ambiente (RT) appena prima dell’uso. Preparare la soluzione di Laminina diluendo la soluzione madre di Laminina (0,1 mg/mL) 1/10 in PBS+/+ freddo (con Ca 2+ e Mg2+).NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nell’Indice dei materiali. Le composizioni delle soluzioni e dei tamponi…

Representative Results

La profilazione fenotipica nei neuroni mDA è un modo efficiente per quantificare molteplici aspetti della biologia cellulare e i loro cambiamenti durante la modulazione sperimentale. Per esemplificare questa metodologia, questo studio ha fatto uso di neuroni LRRK2 G2019S crioconservati e mDA di donatori sani. Questi neuroni sono stati differenziati per circa 37 giorni, sono marcatori neuronali post-mitotici ed espressi (TUBB3 e MAP2) e marcatori neuronali dopaminergici, tra cui la tirosina idrossilasi (TH) in combinazio…

Discussion

La profilazione fenotipica è una tecnica per misurare un gran numero di fenotipi nelle cellule applicando colorazioni fluorescenti, microscopia e analisi delle immagini³. I profili fenotipici possono essere ottenuti e confrontati tra linee cellulari o altre condizioni sperimentali per comprendere i cambiamenti complessi nella biologia cellulare che potrebbero passare inosservati quando si utilizza una singola lettura. Qui descriviamo l’applicazione del profilo fenotipico ai neuroni mDA umani deri…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.